Rilevazione quantitativa SERS dell'acido urico attraverso la formazione di precise nanogiunzioni plasmoniche all'interno di aggregati di nanoparticelle d'oro e cucurbitacee

Questo protocollo offre un metodo versatile per rilevare e quantificare l'acido urico con elevata sensibilità. Si tratta quindi di un protocollo per applicazioni diagnostiche e cliniche. Questo protocollo è in grado di quantificare rapidamente i biomarcatori in una matrice complessa, come i fluidi corporei.

Questa tecnica può essere potenzialmente estesa per diagnosticare malattie che utilizzano l'acido urico come biomarcatore come gotta, ipertensione e malattie cardiovascolari. Può anche essere utilizzato per rilevare e quantificare altre sostanze pericolose per il monitoraggio ambientale. Quando tentano il protocollo per la prima volta, i ricercatori potrebbero avere difficoltà a formare aggregati stabili di CB7 e nanoparticelle d'oro.

Si raccomanda di mescolare le nanoparticelle d'oro in soluzioni CB7 utilizzando la sonicazione poiché altre tecniche potrebbero influenzare la cinetica di aggregazione. Un video che mostra i passaggi critici dell'aggiunta della miscelazione CB7 può aumentare le possibilità di successo e riproducibilità per i ricercatori quando sono nuovi al sistema. Per la sintesi dei semi d'oro, sciogliere 98,5 milligrammi di aurico in 10 millilitri di acqua deionizzata in una fiala di vetro per ottenere una soluzione di cloruro aurico da 25 millimolari e 64,5 milligrammi di polvere di citrato di sodio in 500 microlitri di acqua deionizzata in una fiala di vetro.

Successivamente, diluire un millilitro della soluzione di cloruro aurico con 99 millilitri di acqua in una bottiglia da 250 millilitri con tappo blu per ottenere una soluzione di cloruro aurico 0,25 millimolare e aggiungere 99,5 millilitri della soluzione di cloruro aurico 0,25 millimolare a un pallone a fondo tondo a tre colli da 250 millilitri dotato di condensatore. Quindi riscaldare la soluzione a 90 gradi Celsius sotto agitazione energica per 15 minuti prima di iniettare 500 microlitri della soluzione di citrato di sodio nel pallone, continuando a mescolare fino a quando la soluzione diventa rosso rubino. Per avviare la crescita delle nanoparticelle d'oro, trasferire 25 millilitri della soluzione di semi d'oro in una provetta da 50 millilitri e raffreddare la soluzione a 70 gradi in un ThermoMixer.

Mentre la soluzione si sta raffreddando, riempire una siringa monouso Luer lock da tre millilitri con 2,5 millilitri di soluzione di cloruro aurico da 25 millimolari e riempire un'altra siringa monouso Luer lock da tre millimetri con 2,5 millilitri di soluzione di citrato di sodio da 60 millimolari. Posizionare le siringhe nelle pompe a siringa e utilizzare adattatori da Luer a MicroTight per collegare un tubo in PEEK con diametro interno di 150 micromolari alle siringhe. Inserire il tubo nella provetta da centrifuga contenente la soluzione di semi d'oro raffreddata nel ThermoMixer e impostare entrambe le pompe a siringa per erogare 167,5 microlitri di soluzione in 20 minuti.

Impostare la velocità di rotazione del ThermoMixer a 600 rotazioni al minuto e premere Start sulla pompa a siringa contenente la soluzione di cloruro aurico 25 millimolare. Dopo due minuti, premere Start sulla pompa a siringa contenente la soluzione di citrato di sodio da 60 millimolari. Dopo 30 minuti, rimuovere un'aliquota della soluzione di nanoparticelle d'oro per l'analisi.

Per preparare una soluzione di CB7 0,4 millimolari, aggiungere 4,65 milligrammi di CB7 a un flaconcino di vetro da 15 millilitri e 10 millilitri di acqua al flaconcino. Dopo aver tappato ermeticamente, sonicare la fiala a temperatura ambiente fino a quando il solido CB7 non è completamente sciolto. Per preparare una soluzione di acido urico 0,4 millimolare, aggiungere 2,69 milligrammi di acido urico a una provetta da centrifuga da 50 millilitri e aggiungere 40 millilitri di acqua alla provetta.

Dopo aver tappato ermeticamente, agitare la miscela in un ThermoMixer impostato a 70 gradi Celsius e 800 giri al minuto per due ore. Quando la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, diluire un millilitro della soluzione di acido urico 0,4 millimolare con nove millilitri di acqua in un flaconcino di vetro da 15 millilitri per ottenere una soluzione di acido urico 0,04 millimolare. Dopo aver tappato ermeticamente, sonicare la fiala per 30 secondi.

Per preparare i complessi di acido CB7-urico, aggiungere 750 microlitri della soluzione CB7 0,4 millimolare e 750 microlitri della soluzione di acido urico 0,4 millimolare in una provetta da 1,5 millilitri e sonicare la miscela per 30 secondi. Quindi tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti per garantire la formazione dei complessi ospite-ospite. Fare clic sull'icona delle procedure guidate dell'applicazione di spettroscopia nel software di sistema Raman e selezionare Raman.

Avvia una nuova acquisizione e imposta il tempo di integrazione a 30 secondi, le scansioni in media a cinque e il carro merci a zero. Quindi memorizza lo spettro di fondo e inserisci la lunghezza d'onda del laser. Per la formazione del substrato SERS, aggiungere 900 microlitri della soluzione di nanoparticelle d'oro a 40 nanometri e 100 microlitri di soluzione preformata del complesso di acido CB7-urico in una provetta da 1,5 millilitri e sonicare fino a quando la soluzione cambia da rosso rubino a viola.

Trasferire la soluzione del campione in una cuvetta semi-micro e posizionare la cuvetta nel portacampione Raman. Chiudere il coperchio e avviare la misurazione. Quindi impostare il salvataggio automatico per registrare cinque spettri SERS consecutivi.

Gli spettri visibili ultravioletti per le nanoparticelle d'oro sintetizzate mostrano uno spostamento dei picchi di risonanza plasmonica di superficie localizzata da 521 a 529 nanometri dopo 10 fasi di crescita, mentre i dati di diffusione dinamica della luce mostrano una distribuzione dimensionale ristretta all'aumentare della dimensione delle nanoparticelle da 25,9 a 42,8 nanometri. Le dimensioni medie di G0, G5 e G10 misurate dalle immagini elettroniche a trasmissione sono rispettivamente di circa 20, 33 e 40 nanometri. In queste analisi rappresentative, sono stati formati complessi host-guest di CB7 e acido urico con CB7 vuoto che media la formazione di precise nanogiunzioni plasmoniche all'interno dei nanoaggregati CB7 di nanoparticelle d'oro, come supportato dai segnali caratteristici dell'acido urico nello spettro SERS.

Al contrario, non è possibile osservare alcun segnale SERS di acido urico in assenza di CB7, illustrando il ruolo chiave di CB7 nell'innescare l'aggregazione di nanoparticelle d'oro. L'elevata sensibilità dello schema di rilevamento presentato in questo protocollo è dimostrata dall'osservazione di chiari segnali SERS dai picchi di acido urico a 640 e 1130 centimetri reciproci fino al limite di rilevamento di 0,2 micromolari. Inoltre, correlazioni molto forti tra l'intensità di SERS e le concentrazioni logaritmiche di acido urico sono state ottenute mediante legge di potenza per entrambi i picchi con regioni lineari che si trovano nell'intervallo da 0,2 a 2 micromolari.

L'acido urico ha una bassa solubilità in acqua, quindi è necessario assicurarsi che la polvere di acido urico abbia una morbidezza prima del passaggio successivo. È possibile eseguire un'analisi avanzata dei dati, che consente di quantificare più biomarcatori presenti nella matrice.