Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

L'attuale protocollo mostra in dettaglio la consegna sottoretinica dell'intero organoide retinico in un grande modello animale, con l'obiettivo di sviluppare approcci di terapia cellulare per la degenerazione retinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la consegna di organoidi direttamente al tessuto bersaglio, la retina. La tecnica mira a trattare condizioni degenerative retiniche veicoche avanzate, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa o l'amaurosi congenita di Leber.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Peterson Jones. Per l'impianto sottoretinico degli organoidi, utilizzare le forbici per tenotomia di Stevens per eseguire una cantotomia laterale da 0,5 a 1 centimetro in un gatto anestetizzato a digiuno notturno di quattro mesi e posizionare uno speculum palpebrale di Barraquer di dimensioni appropriate nell'incisione per mantenere le palpebre aperte con un assistente chirurgico che irriga regolarmente la cornea con BSS durante la procedura. Utilizzare una pinza da legatura corneale Castroviejo 0,5 e una piccola emostatica di zanzara per afferrare delicatamente la congiuntiva bulbare vicino al limbus.

Posizionare due suture di seta 6-0 nella congiuntiva immediatamente adiacente al limbus nelle posizioni a ore 4 e 8 per tenere l'occhio nello sguardo primario e per ritrarre la terza palpebra. Bloccare le estremità delle suture con piccoli emostatici di zanzara per aiutare la loro manipolazione e posizionare un'altra sutura a ore 12 nel limbus parzialmente attraverso lo spessore del limbus, facendo attenzione a non penetrare nell'occhio. Annodare liberamente la sutura, tagliando l'estremità corta, e posizionare una sutura di soggiorno nella congiuntiva immediatamente adiacente al limbus a ore 4 per tenere l'occhio e lo sguardo primario.

Riflettere la congiuntiva bulbare tra le ore 10 e le ore 2 e utilizzare le forbici per tenotomia per incidere la congiuntiva a due o tre millimetri dal limbus. Minare la congiuntiva e liberare la capsula di Tenon per esporre la sclera nei siti della porta vitrectomia a ore due e 10 da tre a cinque millimetri dal limbus. Utilizzare i calibri per identificare i siti per la sclerotomia, evitando i principali vasi sclerali che possono essere prominenti nel gatto.

Pianificazione di una regione di tre millimetri alla porta dello strumento a ore 10 per un chirurgo destrorso, pre-posizionare suture a modello crociato poliglactina 6-0 o 7-0 senza legare i siti delle sclerotomie proposte. Una volta che le suture sono in posizione, chiedi all'assistente di afferrare le suture a ore 12 per aiutare a mantenere il globo in posizione e usa una pinza Castroviejo da 0,12 millimetri per tenere il tessuto vicino al sito di sclerotomia. Utilizza un trocar per introdurre una porta di vitrectomia calibro 23 attraverso la sclera in entrambe le posizioni a ore 2 e 10 angolate verso il nervo ottico per evitare il contatto con la lente e utilizzare una pinza di legatura per spingere delicatamente la porta di irrigazione per determinare se le punte possono essere visualizzate all'interno del vitreo.

Chiedi all'assistente di posizionare una lente vitrectomia irrigua Machemer sulla cornea per consentire la visualizzazione del segmento posteriore dell'occhio e una taglierina per sonda per vitrectomia calibro 23 attraverso la porta dello strumento per eseguire una vitrectomia parziale del nucleo. Quindi, introdurre l'ago di una siringa da un millilitro contenente un millilitro di soluzione di triamcinolone nella porta dello strumento e iniettare da 250 a 500 microlitri della sospensione cristallina. Quando la soluzione è stata consegnata, far avanzare la sonda vitrectomia attraverso la porta dello strumento per chiudere la testa del nervo ottico con la porta rivolta lontano dalla superficie retinica.

Utilizzare l'alto vuoto per aiutare a staccare la faccia vitreale dalla retina, inserire l'iniettore attraverso la porta dello strumento verso la superficie retinica ed estrudere la punta della cannula. Premere delicatamente la punta della superficie retinica e chiedere all'assistente di esercitare una leggera spinta rapida sullo stantuffo della siringa per avviare il distacco della retina, riducendo la pressione di iniezione per consentire un lento aumento del distacco di retina fino a raggiungere la dimensione desiderata. Utilizzare una cannula calibro 41 dell'iniettore per allargare leggermente il distacco fino a quando non è possibile introdurre le forbici retiniche e rimuovere la porta sclerale.

Quindi utilizzare un coltello a fessura dritto da 2,850 millimetri orientato verso il nervo ottico per evitare di toccare la lente per ingrandire la sclerotomia in questo sito. Effettuare la retinotomia sul bleb lontano dal nervo ottico per evitare di danneggiare le fibre nervose retiniche provenienti dalla regione trapiantata ed evitare di tagliare i principali vasi retinici per ridurre il rischio di emorragia. Per impiantare gli organoidi, inserire un capillare di vetro caricato con organoidi attraverso la sclerotomia allargata verso il sito di retinotomia e utilizzare la punta del capillare per aprire leggermente la retinotomia per consentire l'accesso all'apertura del bleb sottoretinico.

Chiedere all'assistente di premere lentamente lo stantuffo dell'iniettore per iniettare gli organoidi nel bleb sottoretinico. BSS dovrebbe procedere organoidi, gli organi, e lavare la retinotomia aperta. Quando tutti gli organoidi sono stati consegnati, lasciare il capillare di vetro in posizione per alcuni secondi prima di rimuovere lentamente il capillare dall'occhio, avendo cura di evitare qualsiasi rilascio improvviso di liquido.

Quando il capillare è stato rimosso, chiudere la sclerotomia usando la sutura pre-posizionata in uno schema crociato. Chiedi all'assistente di rimuovere la porta di infusione e legare rapidamente la sutura della sclerotomia e chiudere la peritomia con le suture di poliglactina in un semplice schema continuo. Chiudere la cantotomia laterale con una sutura poliglactina 6-0 e suture cutanee a figura otto per eseguire il canto laterale e utilizzare semplici suture cutanee interrotte per chiudere il resto della ferita.

Quindi somministrare il cocktail di steroidi e antibiotici post-chirurgici appropriati. Il carico di organoidi retinici derivati da cellule staminali pluripotenti umane può essere confermato all'interno della cannula di vetro del dispositivo di iniezione e durante l'intervento chirurgico mediante visualizzazione diretta. La presenza degli organoidi all'interno dello spazio sottoretinico può essere confermata postoperatoriamente dall'esame oftalmico e dall'imaging del fondo oculare.

Prima dell'eutanasia, l'oftalmoscopia laser a scansione confocale e l'imaging con tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale possono anche essere eseguiti per valutare la posizione degli organoidi. Queste tecniche possono essere utilizzate per dimostrare la persistenza di organoidi retinici nello spazio sottoretinico tra la retina neurale e l'epitelio pigmentato retinico dell'occhio ricevente. Le analisi istologiche e immunoistochimiche possono essere utilizzate per illustrare la sopravvivenza dei grafici xenogenici all'interno dello spazio sottoretinico di un grande occhio in un animale immunosoppresso.

Solo coloro che sono esperti in chirurgia vitreoretinica, come oftalmologi veterinari addestrati o chirurghi vitreoretinici che hanno familiarità con le differenze di specie nell'occhio di gatto rispetto all'occhio umano dovrebbero intraprendere questa procedura. La tecnica presentata in questo video dovrebbe essere applicabile ad altri modelli animali di grandi dimensioni che vengono utilizzati per tradurre le tecniche chirurgiche vitreoretiniche alle cliniche.