Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico
5 novembre 2020
Il succo pancreatico è una preziosa fonte di biomarcatori per il cancro del pancreas umano. Descriviamo qui un metodo per la procedura di raccolta intraoperatoria. Per superare la sfida di adottare questa procedura in modelli murini, suggeriamo un campione alternativo, il liquido interstiziale tumorale, e descriviamo qui due protocolli per il suo isolamento.
Il metodo qui descritto per isolare il liquido prossimale sia nell'uomo che nei topi, può essere applicato per studiare il microambiente del cancro del pancreas per identificare nuovi biomarcatori di malattia. Utilizzando questo semplice protocollo, è possibile tradurre i risultati clinici dal succo pancreatico a modelli murini di PDAC per eseguire studi meccanicistici. Il succo pancreatico è un fluido corporeo in gran parte inesplorato che si è dimostrato promettente come fonte di preziosi biomarcatori per aiutare la diagnosi preoperatoria e la profilazione del paziente.
Io mostrerò la prima parte del protocollo, e Marialuisa Barbagallo, una postdoc del nostro laboratorio, dimostrerà la seconda parte del protocollo. Stimare la posizione del dotto pancreatico utilizzando le misurazioni acquisite durante l'imaging. Quindi palpare la superficie anteriore del pancreas per identificare la sua posizione precisa.
Tenere la testa pancreatica nel duodeno dal basso ed elevarla con la mano sinistra, segnando la posizione del dotto pancreatico con il primo dito. Usa la mano destra per inserire una siringa da tre millilitri con un ago calibro 25 nel pancreas, appena distalmente al pollice sinistro. Decidere la profondità di penetrazione e il grado di inclinazione dell'ago in base alle misurazioni preoperatorie e alla percezione di essere penetrati nella parete del condotto.
Prelevare il succo con la siringa. Se non è possibile recuperare il succo, riposizionare l'ago nel tentativo di incannulare il dotto pancreatico. Una volta recuperato il succo pancreatico, spostarlo al di fuori del campo sterile e trasferirlo in una provetta sottovuoto EDTA da tre millilitri.
Mantenere la provetta a quattro gradi Celsius fino a quando il campione non viene trasferito in laboratorio. Per elaborare il succo pancreatico, centrifugarlo a 400 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere eventuali cellule o detriti. Recuperare il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.
Per isolare il liquido interstiziale tumorale o TIF, mediante centrifugazione, tagliare il tumore a metà, sciacquare le due parti in PBS e tamponarle delicatamente su carta da filtro, muovendosi il più velocemente possibile per evitare l'evaporazione dal tumore. Trasferire immediatamente il tumore in un colino cellulare di nylon da 20 micrometri, fissato su una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 400 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Recuperare il TIF dal fondo del tubo, quindi aliquotarlo e congelarlo immediatamente su ghiaccio secco. Conservare a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Per isolare il TIF utilizzando l'eluizione, tagliare il tumore in piccoli pezzi con le forbici o un bisturi e sciacquarli accuratamente con PBS freddo.
Trasferire i pezzi di tumore in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 500 microlitri di PBS con un cocktail di inibitori della proteasi per evitare la degradazione degli analiti. Incubare il tessuto per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri ed eseguire una serie di fasi di centrifugazione a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali cellule dal campione.
Recuperare il surnatante dopo ogni centrifugazione e trasferirlo in una nuova provetta. Dopo l'ultima centrifugazione, aliquotare immediatamente e congelare il campione TIF su ghiaccio secco. Conservalo a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.
Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere il succo pancreatico da pazienti con PDAC e altre afflizioni pancreatiche benigne. Dopo aver filtrato gli ampi segnali NMR delle macromolecole, i segnali provenienti da metaboliti a basso peso molecolare erano evidenti. L'analisi OPLS-DA supervisionata ha mostrato che il profilo metabolico nel succo pancreatico era in grado di discriminare tra pazienti PDAC e non PDAC con un'accuratezza dell'82,4% È interessante notare che l'analisi metabolomica eseguita su campioni di plasma degli stessi pazienti non ha prodotto lo stesso potere discriminante.
Per dimostrare che il contenuto di liquido interstiziale tumorale riflette in modo affidabile i cambiamenti nel microambiente tumorale, due linee cellulari di cancro al pancreas con velocità glicolitiche opposte sono state iniettate per via sottocutanea nei topi. Dopo l'asportazione dei tumori, sono state quantificate le concentrazioni di glucosio e lattato. Il liquido interstiziale tumorale proveniente da tumori altamente glicolitici conteneva meno glucosio e più lattato rispetto ai tumori a basso glicolitico.
In questo studio, abbiamo eseguito l'analisi metabolomica. Tuttavia, questi fluidi prossimali sono adatti per molte altre applicazioni a valle, come la spettrometria di massa e la profilazione dei microRNA.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la raccolta intraoperatoria del succo pancreatico, una fonte preziosa di biomarcatori per il cancro del pancreas. Inoltre, introduce un campione alternativo, il liquido interstiziale tumorale, insieme a protocolli per la sua isolazione in modelli murini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Scoperta di biomarcatori
Sfondo
- Il succo pancreatico è poco esplorato come fonte di biomarcatori.
- Presenta un potenziale nell'aiutare la diagnosi preoperatoria.
- Comprendere il microambiente del cancro del pancreas è fondamentale.
- Tradurre i risultati degli studi sull'uomo in modelli murini può migliorare la ricerca.
Scopo dello studio
- Isolare il succo pancreatico e il liquido interstiziale tumorale per l'identificazione di biomarcatori.
- Fornire protocolli applicabili sia nei modelli umani che murini.
- Facilitare studi meccanicistici sul cancro del pancreas.
Metodi Utilizzati
- Prelievo intraoperatorio di succo pancreatico.
- Isolamento del liquido interstiziale tumorale.
- Tecniche di imaging per localizzare il dotto pancreatico.
- Palpazione del pancreas per un'identificazione precisa.
Risultati principali
- Protocolli dimostrati per l'isolamento di fluidi.
- Evidenziato il potenziale del succo pancreatico come fonte di biomarcatori.
- Mostrata la fattibilità del trasferimento di risultati clinici a modelli murini.
- Fornita una base per futuri studi meccanicistici.
Conclusioni
- Il succo pancreatico e il liquido interstiziale tumorale sono promettenti per la ricerca di biomarcatori.
- I protocolli possono migliorare la comprensione del cancro del pancreas.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare il pieno potenziale di questi fluidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento del fluido prossimale permette un'analisi diretta del microambiente del carcinoma duttale pancreatico, offrendo un percorso verso la scoperta di biomarcatori che colmi il divario tra osservazioni cliniche e studi meccanicistici preclinici. Fornendo metodi tecnicamente accessibili per il prelievo di succo pancreatico e di fluido interstiziale tumorale sia in sistemi umani che murini, il protocollo supporta gli sforzi di validazione di bersagli e lo sviluppo di saggi mirati alle alterazioni del microambiente. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, fornendo fluidi rilevanti per la malattia che riflettono le interazioni tra cellule stromali e tumorali, informando le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di scoperta di farmaci per il cancro del pancreas.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche isolando fluidi che concentrano biomarcatori del microambiente tumorale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per la validazione funzionale di bersagli mediante l'uso di biomarcatori nei fluidi prossimali.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico attraverso l'analisi comparativa di fenotipi tumorali glicolitici mediante la quantificazione di glucosio e lattato nel fluido interstiziale tumorale (TIF).
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara fluidi biologici validati per applicazioni successive, come la spettrometria di massa e il profilo del microRNA.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati e riproducibili di isolamento (centrifugazione ed eluizione) adatti alla scalabilità del saggio.
- Valore scientifico: Produce letture quantitative di metaboliti che consentono il rilevamento di biomarcatori pronti per lo screening con potere discriminante (accuratezza dell'82,4% nell'OPLS-DA).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Stabilisce una continuità rilevante per la malattia traducendo i risultati ottenuti sul succo pancreatico umano in modelli murini di TIF.
- Valore operativo: Facilita la validazione preclinica mediante l'isolamento del TIF da modelli tumorali sottocutanei che riflettono alterazioni del microambiente.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, collegando i profili dei biomarcatori nei fluidi al fenotipo tumorale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto capostipite, consentendo un'analisi del microambiente che orienta gli studi meccanicistici e le campagne di screening guidate da biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando fluidi che riflettono le interazioni stroma-tumore nel PDAC.
- Screening: Permette la prontezza per saggi attraverso l'isolamento standardizzato di TIF e succo pancreatico, ottenendo metaboliti quantitativi e uscite di acidi nucleici.
- Analisi: Fornisce biomarcatori misurabili (glucosio, lattato, metaboliti) per l'analisi comparativa delle condizioni e lo screening fenotipico.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica dimostrando che il TIF riflette lo stato glicolitico del tumore nei modelli murini.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'isolamento di fluidi prossimali in sistemi umani e murini, riducendo le barriere alla traduzione del modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile mediante il rilevamento di biomarcatori microambientali e la validazione degli obiettivi nel PDAC.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità grazie a semplici tecniche di centrifugazione ed eluizione per l'isolamento del TIF.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione collegando i biomarcatori fluidi al fenotipo tumorale, riducendo il rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per rischio basata su profili fluidi discriminanti per biomarcatori (accuratezza dell'82,4% nel distinguere PDAC da non-PDAC).
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione chirurgica dei liquidi e nella dissezione tumorale per l'isolamento del liquido prossimale.
- Necessita di attrezzature per la centrifugazione (400 G, 4°C) e della gestione asettica dei liquidi per l'elaborazione del succo pancreatico e del TIF.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team chirurgico, di anatomia patologica e analitico per garantire l'integrità del campione.
- Comporta considerazioni di adattamento per l'isolamento del TIF murino mediante centrifugazione o eluizione, in base alle dimensioni del tessuto e all'applicazione successiva.
- Comprende limitazioni pratiche, come la difficoltà tecnica nella raccolta del succo pancreatico murino, che rende necessario l'uso del TIF come surrogato.
