Un metodo efficiente per la produzione di adenovirus
June 10th, 2021
Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di adenovirus utilizzando il sistema pAdEasy. La tecnologia include la ricombinazione dei plasmidi pAdTrack e pAdEasy-1, l'imballaggio e l'amplificazione dell'adenovirus, la purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura, la titolazione virale e il test funzionale dell'adenovirus.
Benvenuti all'Istituto di Biologia e Patologia Cellulare, Nicolae Simionescu di Bucarest, Romania. Qui nel Laboratorio di Trasduzione Virale, Mostriamo una parte della produzione di particelle adenovirali utilizzando una metodologia ottimizzata basata sul sistema AdEasy sviluppato dal professor Vogelstein. I passaggi principali della tecnologia per la produzione di questi adenovirus sono, uno, una ricombinazione di pAdTrack contenente GFP con il plasmide pAdEasy-1 nei batteri BJ5183.
Due, immialare le particelle adenovirali. Tre, amplificazione dell'adenovirus nelle cellule AD293. Quattro, purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura.
Cinque, titolazione virale e test funzionali dell'adenovirus. Qui presenteremo un passo importante della metodologia. La purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura.
La purificazione dell'adenovirus inizia con la raccolta delle cellule produttrici di virus e del mezzo. Le cellule AD293 sono state trasfette con il plasmide ricombinante e come l'adenovirus è stato confezionato. Quindi l'adenovirus è stato amplificato da successive culture più grandi.
Qui, abbiamo ottenuto 25 piastre T175, e abbiamo iniziato la purificazione dell'adenovirus dal lisato cellulare e dal mezzo di coltura. In primo luogo, abbiamo controllato la fluorescenza verde del GFP espressa dalle cellule trasdutte. Se le cellule sono ancora attaccate, le staccaremo toccando il piatto di coltura o usando un raschietto lungo.
Le cellule e il mezzo vengono raccolti. I contenitori vengono lavati con PBS, che viene raccolto anche in tubi Falcon. Le cellule sono pellettate dalla centrifugazione.
Conservare il pellet cellulare e il mezzo per un'ulteriore purificazione dell'adenovirus. In questa fase, l'aiuto di un collega è ben apprezzato per accelerare il processo di raccolta. Il pellet cellulare è verde a causa dell'espressione GFP.
Il pellet viene rimosodito in tampone Tris ipertonico, il che faciliterebbe l'interruzione delle cellule. Per la lisi cellulare, utilizziamo azoto liquido e il gas secco riscaldato fino a 37 gradi. Non eseguire più di tre cicli poiché il virus sarebbe danneggiato.
Per aumentare l'efficienza dell'interruzione cellulare passare con cura l'omogeneizzazione cellulare attraverso un ago siringa calibro 23. Centrifugare il llysate cellulare a 9.600 x g per 12 minuti. Passare il supernatante in nuovi tubi e scartare il pellet.
Mantenere il supernatante sul ghiaccio per un'ulteriore lavorazione con ultracentrifugo. Ora, emoboriamo il mezzo di coltura per isolare l'adenovirus rilasciato dalle cellule. Per questo, in primo luogo, pesiamo la quantità necessaria di solfato di ammonio e lo aggiungiamo alla bottiglia in cui è stato raccolto il mezzo di coltura.
La bottiglia viene agitare vigorosamente fino a quando i cristalli non vengono completamente sciolti. La miscela viene incubata a temperatura ambiente per due ore e mezza. Quindi la sospensione del precipitato è divisa in tubi Falcon.
Centrifuga per 15 minuti a 1.600 x g. Dopo la centrifugazione, il supernatante viene scartato e il pellet viene rimescolato in tampone Tris da 10 millimolare. Se non si può continuare la purificazione dell'adenovirus con la fase di ultracentrifugazione, il precipitato può essere mantenuto per alcuni giorni a quattro gradi, ma solo dopo la dialisi per rimuovere il solfato di ammonio.
Qui, abbiamo presentato la fase di dialisi. Usiamo una siringa per introdurre la sospensione in una cassetta precedentemente bagnata. I campioni vengono dializzati contro il tampone Tris da 10 millimolare durante la notte a quattro gradi.
La fase finale della purificazione è rappresentata dalla fase di ultracentrifugazione su un gradiente discontinuo di cloruro di cesio. Per formare il gradiente, in primo luogo, pipettamo tre millilitri della soluzione ad alta densità di cloruro di cesio. Oltre a questo strato, versare delicatamente tre millilitri di cloruro di cesio a bassa densità.
La sospensione della particella adenovirale dal lisato cellulare o dal mezzo di coltura viene quindi sovrapposta al gradiente. I tubi sono riempiti con olio minerale e introdotti nelle benne SW41. Dopo l'equilibrazione, i tubi vengono caricati simmetricamente nel rotore, che viene introdotto nell'ultracentrifugo.
La centrifuga esegue un 35.000 giri/min e quattro gradi per 18 ore senza pausa. Dopo l'ultracentrifugazione, i tubi vengono posizionati su un supporto con una carta nera dietro per raccogliere le bande. La fase superiore chiara e i detriti cellulari vengono scartati in un contenitore di rifiuti con una soluzione di sbiancamento.
La fascia più bassa contenente l'adenovirus completo viene raccolta con una punta di pipetta e raccolta in un tubo sterile di Eppendorf. Dopo la dialisi, il saccarosio viene aggiunto alla sospensione virale a una concentrazione finale del 4% e l'aliquota virale viene mantenuta congelata a meno 80 gradi. Nella sezione risultati, abbiamo mostrato l'espressione GFP nelle cellule trasdotto con l'adenovirus ottenuto.
48 ore dopo la trasduzione, la GFP è espressa dalle cellule trasdutte come mostrato dalla microscopia a fluorescenza. La percentuale delle cellule che esprimono la GFP è determinata dalla citometria del flusso. Circa il 50% delle cellule endoteliali umane e bovine trasdotto con 25 unità di trasduzione per cellula sono positive alla GFP.
La stessa resa di trasduzione è stata ottenuta per gli epatociti murini quando sono state utilizzate solo cinque unità di trasduzione per cellula, ma questo è associato a una maggiore mortalità dovuta alla sensibilità cellulare. Ridotto all'espressione della GFP è stato ottenuto per trasduzione di cellule stromali mesenchimali a causa della bassa espressione dei recettori specifici. Osservazioni conclusive.
Ottimizziamo queste laboriose tecnologie per ridurre il tempo, i costi e lo sforzo necessario per ottenere le particelle adenovirali. L'adenovirus preparato è in grado di infettare vari tipi di cellule e di indotta l'espressione del gene di interesse.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la produzione di particelle adenovirali utilizzando il sistema pAdEasy. Il processo include passaggi chiave come ricombinazione, imballaggio, amplificazione, purificazione e test funzionali degli adenoviri.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia virale
- Terapia genica
- Biologia cellulare
Background
- Gli adenovirus sono ampiamente utilizzati nella terapia genica grazie alla loro capacità di infettare vari tipi di cellule.
- Il sistema pAdEasy è un metodo ottimizzato per la produzione di adenovirus.
- Comprendere il processo di purificazione è cruciale per ottenere particelle virali di alta qualità.
- I marcatori fluorescenti come GFP aiutano a tracciare l'efficienza di trasduzione.
Obiettivo dello studio
- Ottimizzare il protocollo di produzione degli adenovirus per migliorare l'efficienza.
- Fornire una guida completa per i ricercatori nella trasduzione virale.
- Dimostrare l'efficacia degli adenovirus prodotti nell'espressione genica.
Metodi utilizzati
- Ricombinazione di plasmidi in cellule batteriche.
- Imballaggio e amplificazione di particelle adenovirali in cellule AD293.
- Purificazione delle particelle adenovirali dal lisato cellulare e dal mezzo di coltura.
- Test funzionali attraverso l'espressione GFP e la citometria a flusso.
Principali risultati
- È stata ottenuta una purificazione di successo delle particelle adenovirali.
- Circa il 50% delle cellule endoteliali umane e bovine trasdotte ha espresso GFP.
- I rendimenti di trasduzione variavano tra i diversi tipi di cellule.
- L'ottimizzazione ha ridotto il tempo e lo sforzo nella produzione di adenoviri.
Conclusioni
- Il protocollo ottimizzato è efficace per produrre particelle adenovirali.
- Consente un'efficiente consegna genica in vari tipi di cellule.
- Questa metodologia può essere una risorsa preziosa per i ricercatori nella terapia genica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
