Screening CRISPR/Cas9 in vivo per valutare contemporaneamente la funzione genica nella pelle del topo e nella cavità orale

Questo protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di sondare simultaneamente le funzioni soppressive del tumore di centinaia di geni nel cancro della testa e del collo a una frazione del costo di un modello murino knockout convenzionale. Questa tecnica è flessibile e può essere adattata per coprire l'espressione dei geni per studiare la loro funzione nella pelle. Il protocollo di libreria CRISPR mirato può essere applicato anche ad altri tipi di cancro.

Posizionare l'animale anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto sul palco chirurgico riscaldato e utilizzare del nastro chirurgico per tenere le zampe in posizione. Applicare il tubo per anestesia a cono per un apporto costante di isoflurano e ossigeno fino al completamento dell'intervento chirurgico. Per confermare la gravidanza E9.5, applicare una piccola quantità di crema depilatoria sull'addome e stenderla su un'area quadrata di tre centimetri per tre utilizzando un applicatore con punta di cotone.

Dopo due o tre minuti, rimuovere delicatamente la crema con una garza o un fazzoletto e pulire l'area con PBS ed etanolo al 70%. Utilizzando la sonda ecografica e il gel, controllare la topolina incinta per il giorno embrionale E9.5. Questo può essere fatto anche il giorno prima all'E8.5 per risparmiare tempo il giorno dell'intervento.

Rimuovere il gel per ultrasuoni e pulire l'area con BPS e poi etanolo al 70%. Iniettare il più con analgesico sottocutaneo. Quindi si sterilizzano pinze e forbici per praticare un'incisione verticale nella pelle.

Usa una pinza smussata per separare la pelle attorno all'incisione dal peritoneo. Quindi si pinza sterile e forbici per tagliare il peritoneo. Usando una pinza smussata, estrarre delicatamente il corno dell'utero sinistro e destro e contare gli embrioni.

Reinserire la maggior parte delle corna uterine, ma lasciare esposta l'estremità distale di un corno uterino contenente tre embrioni. Usando una pinza smussata, spingere e tirare delicatamente l'utero con i tre embrioni, attraverso l'apertura nella membrana di silicone della capsula di Petri modificata. Stabilizzare la capsula di Petri utilizzando cubetti di argilla da modellare.

Stabilizzare l'utero con i tre embrioni all'interno della capsula di Petri, utilizzando uno stampo in silicone. Quindi appiattire il tappo di silicone sul lato degli embrioni utilizzando uno strumento smussato. Riempire la piastra di Petri con PBS sterile e sciacquare la membrana di silicone sul fondo della piastra di Petri, con la pancia della madre incinta, evitando così qualsiasi perdita.

Spostare la testa dell'ecografo nella capsula di Petri, a circa 0,5 centimetri sopra l'embrione superiore e regolare il tavolino in modo che la cavità amniotica diventi chiaramente visibile nella vista ecografica. Allineare con cura l'ago dell'iniettore nella capsula di Petri modificata. Usando il micromanipolatore, posiziona la punta dell'ago entro cinque millimetri dall'embrione superiore, quindi sposta l'ago avanti e indietro per spostarti sul piano in cui la sua punta appare più luminosa nell'immagine ecografica.

Usando il micromanipolatore, spingere l'ago attraverso la parete uterina nella cavità amniotica. Iniettare 62 nanolitri di lentivirus con la libreria sgRNA a una bassa velocità di iniezione. Premere il pulsante Inietta otto volte per un totale di 496 nanolitri per embrione.

Ripetere la stessa procedura per gli altri due embrioni. Quindi sollevare la testina dell'ecografo e rimuovere il tappo in silicone. Spingere delicatamente i primi due dei tre embrioni nell'addome del topo utilizzando un batuffolo di cotone sterile.

Estrarre i tre embrioni successivi e inserire il terzo embrione precedentemente iniettato. Ripetere la procedura di iniezione fino a quando non viene iniettato il numero desiderato di embrioni, assicurandosi di non superare i 30 minuti di anestesia. Al termine, sollevare la testina dell'ecografo, rimuovere il micromanipolatore con l'ago, aspirare il PBS e rimuovere la piastra di Petri.

Utilizzando salviette sterili, assorbire l'eventuale PBS che potrebbe essersi accumulato nella cavità addominale. Chiudere l'incisione peritoneale utilizzando punti di sutura riassorbibili. Quindi utilizzare due graffette per chiudere l'incisione nella pelle addominale.

Successivamente, le letture di sequenziamento generazionale del DNA amplificato con PCR da cellule trasdotte da plasmidi e librerie lentivirali dovrebbero mostrare un'elevata correlazione. Se l'sgRNA letto dal DNA plasmidico non mostra una rappresentazione uguale di sgRNA, la procedura di preparazione e concentrazione virale deve essere ripetuta con cura. I risultati dell'iniezione ecoguidata di lentivirus che trasporta Cre ricombinasi in cuccioli di topo di coriandoli E9.5 Lox-STOP-Lox al giorno postnatale P0, sono mostrati qui.

Mentre un alto titolo di virus comporterebbe una maggiore copertura della pelle del topo, comporterebbe anche la trasduzione di più sgRNA nella stessa cellula. Questo grafico mostra le letture di sequenziamento di nuova generazione di DNA amplificato con PCR, da cellule trasdotte da plasmidi e librerie lentivirali, nonché letture da quattro tumori rappresentativi. Le guide sgRNA che hanno come bersaglio gli oncosoppressori ADAM10 e RIPK4 sono arricchite nei campioni tumorali rispetto al pool plasmidico o alle cellule infette.

L'esecuzione dell'intervento chirurgico a E9.5 è fondamentale. Ricordarsi di verificare la gravidanza con l'ecografia, nove giorni dopo aver impostato la croce e identificare il punto temporale embrionale in ogni topo femmina. Una volta nati i cuccioli, le cellule trasdotte possono essere isolate e profilate in modo estensivo utilizzando le più recenti tecniche di profilazione genica come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.