Name: Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Scopri come isolare cellule progenitrici adipose da tessuto adiposo epididimale di topo mediante FACS. Questo metodo garantisce alta vitalità e purezza per analisi downstream sensibili come il sequenziamento RNA single-cell.

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Riconosciamo la Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility per l'assistenza allo smistamento FACS.

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state eseguite sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Preparazione della soluzione 
<ol><li>Preparare la soluzione di collagenasi al 2% (w/v) sciogliendo la collagenasi II 2 g nella soluzione salina bilanciata di Hanks da 100 mL (HBSS). Aliquota 200 μL ciascuno per ogni utilizzo.</li>
	<li>Preparare il mezzo di neutralizzazione mescolando 84 mL F-12 medium, 15 mL di siero di cavallo e 1 mL penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Preparare il tampone di citometria a flusso sciogliendo 500 mg di albumina di siero bovino (BSA) e 400 μL di 0,5 M EDTA in 100 mL della salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco.</li>
</ol>2. Dissezione del cuscinetto adiposo epididimale e della dissociazione tissutale
<ol><li>Eutanasia umana (isoflurane/lussazione cervicale) di un topo maschio. In questo protocollo è stato utilizzato un mouse FVB di quattro mesi.</li>
	<li>Applicare/spruzzare il 70% di etanolo sull'addome ed esporre la cavità addominale inferiore utilizzando forbici e forcep pulite.</li>
	<li>Individuare il cuscinetto grasso epididimico (prossimale/attaccato ai teste). Tenere la giunzione tra teste e cuscinetto grasso epididimale con forcette smussate e tirare delicatamente per liberare il cuscinetto grasso epididimale.</li>
	<li>Rimuovere i teste tagliando con forbici e incubare il cuscinetto di grasso epididimale in 5 ml di HBSS integrato con 3% di BSA in un tubo conico da 50 ml a temperatura ambiente per 15 minuti.</li>
	<li>Centrifuga a 150 x g per 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Prendere il cuscinetto di grasso epididimale galleggiante dal tubo conico da 50 ml e tritare finemente il tessuto usando forbici pulite.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di collagenasi soluzione al 2% in 3,8 ml di HBSS in un tubo di coltura da 13 ml. Aggiungere il tessuto tritato e incubare in un'incubatrice rotante a 5 giri/min per 1 h a 37 °C. Invece di un incubatore rotante, l'incubatore di coltura cellulare a 37 °C può essere usato alternativamente con agitazioni occasionali.</li>
	<li>Trasferire l'intero contenuto in un tubo conico da 50 ml e aggiungere 10 ml di mezzo di neutralizzazione. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 2-3 volte.</li>
	<li>Preparare un altro tubo conico da 50 ml dotato di un filtro a celle da 70 μm. Filtrare il tessuto digerito nel nuovo tubo utilizzando il filtro cellulare.</li>
	<li>Trasferire il flusso fino a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 350 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere con cura i pellet di cellule supernatanti e resuspend con 5 mL di DPBS. Centrifuga a 350 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 50 μL di tampone di citometria di flusso. Mescolare bene tubazione delicatamente e mantenere le cellule sul ghiaccio. A causa del volume del pellet cellulare e della piccola quantità di supernatante residuo, il volume totale di cellule nel buffer di citometria del flusso sarà maggiore di 50 μL (circa 100 μL).</li>
</ol>3. Etichettatura degli anticorpi e smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS)
<ol><li>Dopo aver mescolato bene le cellule con una tubazione delicata, trasferire 54 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,7 ml. Aggiungere 6 μL di reagente bloccante FcR e mescolare bene tubazione delicatamente. Incubare a 4 °C per 10 min. Salvare le cellule rimanenti dopo aver preso 54 μL e tenerle nel ghiaccio da utilizzare come controllo non macchiato nel passaggio 3.5 e nel passaggio 3.6.</li>
	<li>Durante l'incubazione nella fase 3.1, preparare un cocktail di anticorpi combinando 11 μL ciascuno di anticorpi anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anti-CD45-FITC in un tubo di microcentrifugo. Mescolare bene con una pipettazione delicata e mantenere il ghiaccio protetto dalla luce.</li>
	<li>Dopo l'incubazione con reagente bloccante FcR per 10 min, aggiungere 40 μL del cocktail anticorpale e mescolare bene con pipettaggio delicato. Incubare a 4 °C per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso integrato con 1 μg/mL di DAPI nelle celle macchiate. Mescolare bene con tubazioni delicate e celle filtranti utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro a celle. Tieni le cellule sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di citometria di flusso alle cellule rimanenti nel passaggio 3.1 e mescolare bene con una pipettazione delicata. Filtrare le celle utilizzando una provetta da 5 ml con tappo a scatto del filtro cellulare. Tenere queste cellule sul ghiaccio e utilizzarle come controllo non macchiato nel passaggio seguente.</li>
	<li>Porta le celle macchiate e il controllo non macchiato allo strumento di analisi o ordinamento FACS.<ol>
<li>Identificare e isolare la popolazione APC+/FITC-/DAPI- con strategie di gating mostrate nella figura 1. Queste celle rappresentano cellule Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. I detriti e gli aggregati cellulari sono esauriti utilizzando grafici a dispersione in avanti (FSC) e a dispersione laterale (SSC). Quindi, DAPI- la popolazione è gated, seguita da gating di APC+/ FITC- popolazione. I controlli non macchiati devono essere utilizzati per aiutare a impostare i parametri di gating.</li>
		<li>Raccogliere le cellule in 500 μL di tampone di citometria di flusso in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Andando avanti, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili per ridurre al minimo una contaminazione. Circa 50.000 - 100.000 cellule vengono raccolte da un topo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contare le cellule usando un emocitometro per valutare la vitalità cellulare. Poiché gli aggregati cellulari possono interferire con ulteriori analisi a valle, viene valutata anche la presenza di aggregati cellulari per garantire una presenza minima (<5% del numero di cellule vitali) di questi aggregati.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sta rapidamente guadagnando trazione come un potente strumento per studiare contemporaneamente diverse popolazioni cellulari a livello di singola cellula. A causa degli elevati costi associati alla preparazione del campione e all'elevato sequenziamento della produttività, è imperativo ottimizzare gli input cellulari (alta vitalità e purezza) per aumentare la probabilità di successo sperimentale. Alcuni protocolli di preparazione cellulare si basano sulla rimozione ...

Il tessuto adiposo gioca un ruolo chiave nel metabolismo energetico. L'energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi e il tessuto adiposo è in grado di espansione o retrazione significativa a seconda dello stato nutrizionale e della domanda energetica. L'espansione del tessuto adiposo può derivare da un aumento delle dimensioni degli adipocite (ipertrofia) e/o da un aumento del numero di adipocite (iperplasia); quest'ultimo processo strettamente regolato dalla proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici adipose1,2. Durante l'obesità, il tessuto adiposo si espande eccessivamente e la disfunzione tissutale - tra cui ipossia, infiammazione e resistenza all'insulina -si sviluppa spesso 3,4. Queste complicanze sono fattori di rischio per molte malattie croniche tra cui ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari, ictus e cancro5. Pertanto, limitare l'espansione incontrollata dei tessuti adiposi e mitigare le patologie tissutali adipose sono le principali priorità di ricerca biomedica. Durante l'espansione del tessuto adiposo, le cellule staminali derivate dai tessuti adiposi residenti (ASC) proliferano e si differenziano in sequenza in preadipociti (cellule progenitrici impegnate) e quindi in adipociti maturi6. Recenti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) mostrano che queste popolazioni di cellule progenitrici adipose (APC) (ASC e preadipociti) mostrano una sostanziale eterogeneità molecolare e funzionale7,8,9,10,11,12. Ad esempio, gli ASC mostrano una ridotta capacità di differenziazione adipogenica, ma presentano anche maggiori capacità di proliferazione ed espansione, rispetto ai preadipociti7. Ulteriori differenze molecolari sono riportate all'interno delle popolazioni ASC e preadipocite, anche se la rilevanza funzionale di queste differenze rimane poco chiara7. Insieme, questi dati evidenziano la complessità del pool di cellule progenitrici adipose e sottolineano la necessità di sviluppare e standardizzare strumenti per comprendere e manipolare meglio queste popolazioni di cellule critiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici ad alta vitalità Sca1+ adipose dalle pastiglie di grasso epididimomale del topo adatte per analisi sensibili a valle, tra cui studi a cella singola (sequenziamento scRNA) e coltura cellulare. L'isolamento e la dissociazione dei cuscinetti di grasso epididimali è statoeseguito come descritto in precedenza 7,13 con lievi modifiche che migliorano la vitalità delle APC isolate. In breve, le cellule dissociate dai cuscinetti adiposi epididimali sono macchiate di anticorpi contro Sca1, un marcatore sia per gli ASC che per i preadipociti6,7e altri marcatori di lignaggio (Lin): Ter119 (cellule erythroid), CD31 (cellule endoteliali) e CD45 (leucociti). Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- le celle vengono quindi ordinate in base all'ordinamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS). È importante sottolineare che questo protocollo è stato convalidato da un riuscito isolamento e analisi di cellule progenitrici sca1+/lin- adipose praticabili riportate in un recente studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula che ha identificato sottopopolazioni funzionalmente eterogenee all'interno di ASC e preadipociti7.

<table><tbody><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per coltura da 13 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 5 mL con filtro cellulare tappo a scatto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro cellulare m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Sca1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Codice 130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

L'obesità e i disturbi metabolici come diabete, malattie cardiache e cancro sono tutti associati a un drammatico rimodellamento dei tessuti adiposi. Le cellule progenitrici adipose residenti nei tessuti (APC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi dei tessuti adiposi e possono contribuire alla patologia tissutale. L'uso crescente di tecnologie di analisi a singola cellula , tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la proteomica a singola cellula, sta trasformando il campo delle cellule staminali / progenitrici consentendo una risoluzione senza precedenti dei cambiamenti di espressione delle singole cellule nel contesto dei cambiamenti a livello di popolazione o tessuto. In questo articolo, forniamo protocolli dettagliati per sezionare il tessuto adiposo epididimale del topo, isolare le singole cellule derivate dai tessuti adiposi ed eseguire lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per arricchire per uno Sca1+/ CD31-/CD45-/Ter119- APC praticabile. Questi protocolli consentiranno agli investigatori di preparare APC di alta qualità adatti per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA a cella singola.

In questo esperimento sono stati utilizzati topi FVB maschi di quattro mesi. Dopo l'esclusione di detriti e doppietti utilizzando appezzamenti FSC/SSC, le cellule vitali (DAPI- popolazione) sono state gated, seguite dalla selezione di APC+/FITC- popolazione (Figura 1). I gate DAPI, APC e FITC sono stati disegnati in base al controllo non macchiato. Le strategie di gating sono mostrate nella figura 1.
D...

Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Questo protocollo consente di isolare cellule progenitrici adipose di alta qualità dal tessuto adiposo dell'epididimo di topo per un'analisi sensibile a valle. Questa tecnica produce cellule progenitrici adipose altamente vitali ed è stata convalidata in un recente studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Dopo l'eutanasia del topo maschio, individua il cuscinetto adiposo dell'epididimo e tiralo delicatamente con una pinza smussata per deliberarlo.Usa le forbici per rimuovere i testicoli e incubare il cuscinetto adiposo dell'epididimo in cinque millilitri di HBSS integrato con il 3% di BSA in una provetta conica da 50 millilitri per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta a 150 x g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il cuscinetto adiposo dell'epididimo galleggiante dal tubo conico e tritarlo finemente con le forbici pulite.Aggiungere 200 millilitri di soluzione di collagenasi al 2% a 3,8 millilitri di HBSS in una provetta di coltura da 13 millilitri. Quindi aggiungere il tessuto tritato e incubarlo in un incubatore rotante a cinque RPM per un'ora a 37 gradi Celsius. Trasferire l'intero contenuto in una provetta conica da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di mezzo neutralizzante.Mescolare delicatamente capovolgendo il tubo due o tre volte. Preparare un'altra provetta conica da 50 millilitri dotata di un colino cellulare da 70 micrometri e filtrare il tessuto digerito nella nuova provetta. Trasferire il flusso in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 350 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con cinque millilitri di DPBS. Quindi centrifugare la provetta per altri 10 minuti. Rimuovere con cautela il surnatante e aggiungere 50 microlitri di tampone per citometria a flusso.Mescolare le cellule pipettando delicatamente e tenerle in ghiaccio. Il volume totale delle cellule nel tampone per citometria a flusso sarà di circa 100 microlitri. Dopo aver miscelato le cellule, trasferire 54 microlitri di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri.Aggiungere sei microlitri di reagente bloccante FCR e pipettare delicatamente per mescolare. Quindi incubare la provetta a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Conservare le cellule rimanenti sul ghiaccio per utilizzarle come controllo non colorato.Durante l'incubazione, preparare un cocktail di anticorpi combinando 11 microlitri ciascuno di anticorpi anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anti-CD45-FITC in una provetta da microcentrifuga. Pipettare delicatamente il composto e tenerlo sul ghiaccio al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione con il reagente bloccante FCR, aggiungere 40 microlitri del cocktail di anticorpi e mescolare bene con un pipettaggio delicato.Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per altri 10 minuti. Aggiungere 500 microlitri di tampone per citometria a flusso integrato con un microgrammo per millilitro di DAPI nelle cellule di colorazione. Mescolare bene e filtrare le cellule utilizzando una provetta da cinque millilitri con un tappo a scatto per filtro cellulare.Quindi mantieni le celle sul ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di tampone per citometria a flusso alle cellule non colorate e mescolare pipettando delicatamente. Utilizzare una provetta da cinque millilitri con un tappo a scatto per filtrare le cellule e mantenerle sul ghiaccio.Trasportare le cellule colorate e il controllo non colorato allo strumento di analisi o di smistamento FACS. Identificare e isolare la popolazione APC-positiva, FITC-negativa, DAPI-negativa utilizzando le strategie di gating descritte nel manoscritto del testo. Utilizzare i controlli non colorati per facilitare l'impostazione dei parametri di iniezione.Dopo l'esclusione di detriti e doppietti utilizzando i grafici FSC-SSC, le cellule vitali sono state gated seguite dalla selezione della popolazione APC-positiva e FITC-negativa. I cancelli DAPI, APC e FITC sono stati disegnati in base al controllo non colorato. I seguenti risultati mostrano l'isolamento di cellule progenitrici adipose da topi FVB maschi di quattro mesi.Dopo un'ora di smistamento, la qualità dell'isolamento è stata valutata quantitativamente mediante analisi di citometria a flusso, che ha dimostrato che le cellule mantenevano un'elevata vitalità e purezza. Dopo questo protocollo è possibile eseguire analisi sensibili a valle, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, la PCR quantitativa in tempo reale e la citometria a flusso. Ciò consentirà un'ulteriore caratterizzazione delle cellule progenitrici adipose.Le cellule progenitrici adipose sono popolazioni eterogenee che richiedono ulteriori studi su singole cellule. Questo metodo consente di isolare le cellule adatte per studi su singola cellula.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

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Biologia

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule staminali derivate dalla cresta neurale (ADSC) derivate da creste neurali marcate in modo fluorescente da tessuto adiposo dell'arco periaortico murino. Dopo l'isolamento, le NCADSC vengono rilevate, selezionate utilizzando la smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza e successivamente coltivate su una piastra, promuovendo la proliferazione cellulare.

Isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa da tessuto adiposo periaortico murino

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

L&#39;espansione e l&#39;adipogenesi dell&#39;induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Isolamento, espansione in vitro e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo epididimo di topo

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Scopri come isolare cellule progenitrici adipose da tessuto adiposo epididimale di topo mediante FACS. Questo metodo garantisce alta vitalità e purezza per analisi downstream sensibili come il sequenziamento RNA single-cell.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

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