Name: Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri le tecniche di carta assorbente e vaso infetto per analizzare l'interazione tra ceci e Rhizoctonia bataticola. Questi metodi permettono di studiare i meccanismi di infezione fungina e valutare la tolleranza delle piante.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I progetti del laboratorio M.S.K sono supportati dal finanziamento principale del National Institute of Plant Genome Research. VI riconosce DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Ringraziamo gli studenti tirocinanti, miss Rishika, Jayachendrayan e Miss Durgadevi per l'aiuto tecnico durante le riprese video e il signor Sandeep Dixit, la signorina Anjali e il dottor Avanish Rai per aver valutato criticamente i dati grezzi e i file manoscritti. Ringraziamo il signor Rahim H Tarafdar e il signor Sunder Solanki per il loro aiuto in laboratorio. Riconosciamo il Consorzio DBT-eLibrary (DeLCON) e la Biblioteca NIPGR per aver fornito l'accesso alle risorse e-resources e al NIPGR Plant Growth Facility per il supporto /spazio per la crescita degli impianti.

1. Isolamento di R. bataticola e stoccaggio
<ol><li>Dettagli del genotipo ceci e dei sintomi drr<ol>
<li>Utilizzare piante di ceci (genotipo, JG 62) che generalmente mostrano sintomi tipici della DRR, come radice primaria secca e fragile senza radici laterali e microsclerotia sotto la corteccia e all'interno del midollo1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta e lavaggio<ol>
<li>Piante sradiche che mostrano sintomi come fogliare di colore paglierino secco e radice primaria fragile con microsclerotia sotto lo strato di epidermide. Durante lo sradicamento, una parte importante delle radici rimarrà all'interno del terreno poiché le radici infette sono fragili. Rimuovere i detriti grossolani del terreno attaccati alla radice. Tagliare le radici separatamente e raccoglierle in buste di carta (27,5 cm x 12 cm) con l'etichetta corretta e posizionarle in una scatola di raccolta del campione.</li>
		<li>Dopo aver trasportato i campioni in laboratorio, posizionare le radici in un bicchiere da 200 mL e coprire con rete (rete di nylon con dimensioni dei pori di 3 mm di diametro) e lavare accuratamente le radici con acqua di rubinetto corrente per rimuovere le particelle del terreno aderenti.</li>
		<li>Utilizzare acqua di osmosi inversa (RO) per risciacquare una volta alla fine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilizzazione superficiale<ol>
<li>Rompere le radici in quattro pezzi con una lunghezza di 2 cm ciascuno con una lama bisturi e metterli in un becher pulito da 200 mL.</li>
		<li>Assembla acqua RO autoclavata, NaOCl al 2%, barattolo di scartamento e carta assorbente autoclavata (5 cm2)all'interno della camera di flusso laminare.</li>
		<li>Lavare le radici con 50 mL di acqua RO autoclavata tre volte e poi con 50 mL di 2% NaOCl per 10 min. Lavare le radici con 50 mL di acqua RO tre volte di nuovo per rimuovere il NaOCl.</li>
		<li>Asciugare le radici posizionando le radici su carta assorbente autoclavata e lasciare fino a quando le radici non vengono asciugate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Media e incubazione<ol>
<li>Rimuovere i bordi delle radici con una lama di bisturi sterilizzata. Dividere le radici usando la lama e utilizzare le forcelle sterilizzate per posizionarle su una piastra di Petri media di destrosio di patate (PDA) contenente solfato di streptomicina (50 mg L-1)e ampicillina (50 mg L-1).</li>
		<li>Chiudere la piastra, sigillare con parafilm e incubare in un'incubatrice a 28 °C per due giorni al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metodo della punta hyphal<ol>
<li>Dopo due giorni di incubazione, portare le piastre nella camera di flusso laminare. Tagliare la punta della crescita ifale8 sotto uno stereomicroscopio (stereomicroscopio educativo Leica EZ4) e trasferirla in una piastra PDA fresca con solfato di streptomicina e ampicillina.</li>
		<li>Incubare le piastre nell'incubatrice a 28 °C per dieci giorni al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservazione e manutenzione dell'inoculo fungino R. bataticola<ol>
<li>Fare inclinazioni PDA in provette e trasferire una spina di agar fungina da una piastra di coltura vecchia di dieci giorni utilizzando il circuito di inoculazione sterilizzato a fiamma. Sigillare il tappo della provetta con parafilm.</li>
		<li>Incubare le inclinazioni a 28 °C per dieci giorni al buio.</li>
		<li>Sigillare nuovamente il cappuccio con parafilm e conservarlo a 4 °C in frigorifero per un uso futuro.</li>
		<li>Sottocultura ogni sei mesi per mantenere il fungo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenimento della virulenza<ol>
<li>Infettare le piante con puro inoculo fungino preparato come menzionato nella tecnica del vaso malato3. Isolare lo stesso fungo dalle piante infette (postulati di Koch)9 e utilizzarlo per ulteriori esperimenti. NOTA: In questo studio è stato utilizzato un ceppo isolato sul campo del fungo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tecnica della carta assorbente
NOTA: La tecnica della carta assorbente comporta la preparazione di inoculo fungino liquido, preparazione delle piantine e valutazione della malattia.
<ol><li>Preparazione del liquido R. bataticola inoculum NOTA: L'inoculo fungino liquido R. bataticola contiene sia micelia che microsclerotia. Entrambe queste strutture fungono da inoculo primario.<ol>
<li>Preparare 500 mL di supporti PDB in un pallone da 1.000 ml e autoclave a 121 libbre per 15 minuti.</li>
		<li>Dopo che il supporto è stato raffreddato, inoculare il brodo con un loopful di spina di agar fungino da una coltura fungina e incubare a 28 °C per cinque giorni in uno shaker a 180 giri/min al buio.</li>
		<li>Assembla un imbuto in vetro autoclavato o plastica (10 cm), un pallone conico da un litro e due strati di rete (dimensioni 10 cm2) (rete di nylon con la dimensione dei pori di 3 mm di diametro) sul tavolo. Filtrare la micelia fungina e la microsclerotia usando la rete. Asciugare il fungo in carta assorbente autoclavata.</li>
		<li>Pesare 100 g di mecelia per il 50% di inoculo e mantenere a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della pianta di ceci<ol>
<li>Selezionare 50 semi sani (in questo studio è stato utilizzato il genotipo JG 62 suscettibile alla DRR), metterli in un becher da 100 mL e coprire con una rete.</li>
		<li>Lavare prima i semi con acqua del rubinetto per rimuovere i detriti del terreno.</li>
		<li>Portare il becher con i semi nella camera di flusso laminare e lavarli con 50 mL sterilizzati di acqua RO tre volte per 1 minuto per lavaggio.</li>
		<li>Sterilizzare i semi con 50 mL di NaOCl acquoso al 2% per 2 minuti con scuotimento continuo e lavare i semi con 50 mL di acqua sterilizzata cinque volte per 1 minuto ciascuno.</li>
		<li>Riempire un sacchetto di politene (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una miscela di perlite espansa di grado orticolo, muschio di torba irlandese e vermiculite esfoliata in rapporto uguale, cioè, 1/3:1/3:1/3), seminare i semi sterilizzati in superficie 50 semi due cm di profondità e conservare in una camera di crescita/stanza con 28 °C ± 2 °C di temperatura, 16 h fotoperiodo con un'intensità luminosa di 150 μmol m−2 s−1e umidità relativa del 70%. Innaffiarli con acqua RO e sradicare le piante otto giorni dopo la semina.</li>
		<li>Lavare le radici nell'acqua del rubinetto per rimuovere le particelle di Soilrite. Risciacquare le radici con acqua RO sterilizzata e tenerle nell'acqua RO in un bicchiere da 1000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della carta assorbente in vassoi<ol>
<li>Prendi una carta assorbente e tagliali a pezzi (30 cm × 23 cm) in numero sufficiente per soddisfare le repliche.</li>
		<li>Imballare le lenzuola in un sacchetto di polietilene autoclavabile e autoclavarle a 121 libbre per 15 minuti e tenerle in un forno ad aria calda per l'asciugatura.</li>
		<li>Piegare ogni foglio di carta assorbente a metà.</li>
		<li>Posizionare la carta su un vassoio di plastica pulito e pulito dallo spirito, come illustrato nella figura 2i-iv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculazione delle piante mediante immersione<ol>
<li>Sciogliere 100 g di inoculo fungino in acqua RO autoclavata da 200 mL in un bicchiere da 200 mL per ottenere il 50% di inoculo.</li>
		<li>Immergere le radici della pianta nell'inoculo preparato per 1 minuto con movimento intermittente su e giù per garantire un attacco uniforme dell'inoculo fungino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare le piante nella carta assorbente<ol>
<li>Bagnare il lato inferiore della carta assorbente posta sul vassoio con acqua RO sterile. Posizionare le piante sulla carta in un modo in cui solo le radici sono coperte dalla carta e i germogli vengono lasciati fuori.</li>
		<li>Chiuderlo piegando il lato superiore della carta assorbente e bagnare l'intera carta per fornire abbastanza acqua per sostenere la crescita delle piante.</li>
		<li>Innaffia il vassoio una volta al giorno e tieni i vassoi a 28 °C. Osserva quotidianamente i sintomi come necrosi, marciume radicale e ingiallimento delle foglie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tecnica del vaso malato
NOTA: La tecnica del vaso malato comporta la preparazione di inoculo virulento e una pentola malata, il mantenimento del livello di umidità e la valutazione dei sintomi della malattia.
<ol><li>Preparazione del substrato<ol>
<li>Prendi un kg di qualsiasi semi di ceci disponibile in commercio. Rimuovere i semi infetti (semi con crescita fungina, macchie di infezione e danni agli insetti). Metterli in becher di plastica da 5 L e lavare accuratamente con acqua del rubinetto 3-4 volte per rimuovere i detriti principali.</li>
		<li>Lavare i semi con 2 L di acqua RO tre volte e immergere i semi da 1 kg in un bicchiere da 5 L con tre volte più acqua per cinque ore.</li>
		<li>Una volta che i semi hanno assorbito l'acqua, lavarli nuovamente con acqua RO per rimuovere gli essudati del seme.</li>
		<li>Rimuovere completamente l'acqua e imballare i semi in bottiglie di marmellata (300 mL, 12 cm di altezza, 6 cm di diametro e 155 g di peso) a circa 1/4di capacità (100 g per flacone di marmellata) e chiudere le bottiglie con tappi. Imballare dieci bottiglie di marmellata in un sacchetto di plastica autoclavabile (48 cm x 30 cm) autoclave due volte a 121 libbre per 15 minuti ininterrottamente.</li>
		<li>Asciugare i semi a 40 °C in forno durante la notte per rimuovere le goccioline d'acqua all'interno della bottiglia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della cultura malata<ol>
<li>Accendere la camera di flusso laminare a livello BSL-2. Pulire accuratamente il pavimento con il 70% di etanolo e accendere l'UV per 15 minuti. Quindi, tenere i semi all'interno della camera di flusso laminare.</li>
		<li>Prendi la cultura R. bataticola appena isolata di 10 giorni (parte 1). Quindi, prendere tre tappi di agar fungino (diametro 4 mm) utilizzando una punta sterile di pipetta o una borsista di sughero e metterli in bottiglie di marmellata a livello aettico. Coprire le bottiglie con tappi e sigillare con parafilm.</li>
		<li>Agitare le bottiglie per mescolare il disco fungino con i semi di ceci in modo uniforme.</li>
		<li>Incubare le bottiglie a 30 °C per 15 giorni al buio.</li>
		<li>Prendere le bottiglie di marmellata con crescita fungina nera(Figura 4iii)e trasferire la coltura malata (semi con microsclerotia) dalle bottiglie di marmellata a una piastra di Petri di vetro utilizzando forcep sterili. Asciugarli a temperatura ambiente per due giorni in una piastra di Petri di vetro.</li>
		<li>In polvere la massa fungina usando un mortaio e un pestello e conservare la polvere a 4 °C.</li>
		<li>Autoclave Soilrite due volte a 121 libbre per 15 min.</li>
		<li>Asciugare il mix di Soilrite autoclavato sotto un ombrellone.</li>
		<li>Mescolare la polvere fungina con Soilrite al 50% w/w, riempire i vasi con la miscela e mantenerli a temperatura ambiente per un giorno.</li>
		<li>Seminare un seme di ceci resistente alla DRR sterilizzato in superficie per vaso (vasi rotondi di 10 cm)(Tabella dei materiali)e mantenere un livello di umidità dell'80% di capacità di campo (FC).</li>
		<li>Osserva i sintomi come necrosi e marciume radicale sradicando le piante dopo la germinazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valutazione dell'efficienza del vaso malato NOTA: Le piante mostrano sintomi fogliari gialli quando le radici sono completamente marce.<ol>
<li>Sviluppare un punteggio di malattia basato sui numeri della lesione (macchie necrotiche) (Figura supplementare 2C) e sulla gravità del marciume radicale. Vasi malati che mostrano il 90% di morte vegetale possono essere utilizzati ulteriormente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Screening genotipo<ol>
<li>Preparare la coltura malata in grandi quantità e mescolarla con Soilrite sterilizzata o terreno di campo (5% w/w) in vasi alti 30 cm. Innaffiare le pentole per bagnare la superficie e lasciarle indisturbate per sette giorni.</li>
		<li>Seminare un seme sterilizzato in superficie per 10 cm di pentola rotonda e tre semi per vasi rotondi di 30 cm e annaffiarli adeguatamente.</li>
		<li>Osservare i sintomi del marciume fogliare e radicale giallo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siccità combinata e infezione da R. bataticola<ol>
<li>Imporre lo stress da siccità seguendo i protocolli menzionati in Sinha et al.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare

La tecnica della carta assorbente fornisce un approccio diretto ai genotipi di ceci dello schermo in condizioni di laboratorio. L'inoculazione a immersione consente lo studio dell'interazione su base temporale con un facile controllo del carico di inoculo(figura complementare 1)e facilita lo screening in vitro. Inoltre, possono essere utilizzate anche giovani piantine. La coltura fungina di cinque giorni(figura 1B)può produrre abbastanza inoculo da infettare le piante. L'ino...

Il marciume della radice secca (DRR) è una delle malattie economicamente significative nelceci 1,2. È una malattia specifica della radice causata da Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrophomina phaseolina). Le piante infette mancano di radici laterali e possiedono radici di rubinetto fragili e fogliamegiallo 1,3. Drr sotto stress da siccità è stato segnalato come una minaccia emergente per la coltivazione diceci 1,2,3. Inoltre, si dice che l'incidenza della DRR sia aggravata dallo stress da siccità nellecondizioni di campo 1,2,3. La DRR è più diffusa nelle aree piovose che nei campi irrigati4. L'utilizzo di varietà resistenti è il modo per superare la malattia ed aggirare l'uso difungicidi 1,13. Poiché il germoplasma di ceci disponibile in tutto il mondo ospita variazioni genetiche per il tratto5, lo screening e l'identificazione di genotipi resistenti / sensibili sono fondamentali per l'allevamento molecolare per il miglioramento delle colture.
Test di malattia robusti, facili ed efficaci in termini di costi sono essenziali per indagare i modelli di infezione da R. bataticola nei ceci. Il test della malattia primaria utilizzato per osservare la risposta dei genotipi di ceci all'infezione da R. bataticola è la tecnica della cartaassorbente 1,4. È una tecnica semplice e può essere eseguita utilizzando inoculo fungino liquido, piantine con radici e carta assorbente sterile. Tuttavia, questa tecnica non è stata utilizzata al massimo perché non è disponibile alcun protocollo passo-passo in letteratura.
Nel frattempo, la tecnica del vaso malato prevede la preparazione di una potenziale cultura malata e l'imposizione dello stress da siccità. Dato che lo stress da siccità aggrava l'incidenza della malattia DRR3, è essenziale studiare l'interazione pianta-patogeno sotto lo stress dasiccità 6,7. La tecnica del vaso malato fornisce la piattaforma per uno studio così simultaneo, promuovendo migliori possibilità per lo screening del germoplasma e comprendendo le basi meccaniche dell'interazione. I cambiamenti patologici, ad esempio l'aumento della lunghezza delle radici e la riduzione del numero di radici laterale, inerenti alla malattia DRR, possono essere affrontati utilizzando la tecnica delvaso malato 1,3,7.
Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la carta assorbente e le tecniche di pentola malata, che può essere utilizzato per studiare l'interazione tra ceci e R. bataticola e germplasma di ceci dello schermo. I dettagli dei materiali utilizzati nello studio sono riportati nella tabella dei materiali.

<table><tbody><tr><td>Fungo- Rhizoctonia bataticola</td><td>Inoculo patogeno</td><td>Collezione di colture di tipo indiano n. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Soilrite mix</td><td>Terreno in laboratorio</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, India</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Carta assorbente per sostenere la crescita delle piante</td><td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Vaso</td><td>Piante in crescita</td><td>Vasi da 10 e 30 cm</td><td>Vasi da vivaio usati abitualmente, ad esempio, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Destrosio di patata agar/brodo</td><td>Coltura e mantenimento del fungo</td><td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Coltura del fungo</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubatrice e agitatore</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Camera di crescita</td><td>Piante in crescita in condizioni controllate</td><td>Modello n. A1000, Conviron, Canada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Flusso d'aria laminare</td><td>Esecuzione di esercizi asettici</td><td>Telstar, Bio II advance, armadio di classe II, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Filtraggio dei miceli fungini</td><td>Zanzariera in nylon</td><td>Mesh con dimensioni dei pori di 0,6-1 mm di diametro</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Mezzi di sterilizzazione in autoclave e semi di ceci</td> Microscopi <td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td><td>autoclave</td></tr><tr><td></td><td>Visualizzazione dell'infezione da miceli fungini</td><td>SMZ25 / SMZ18, Stereomicroscopi da ricerca, Stereomicroscopio</td> <td>didattico Leica EZ4https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Pesatura di funghi e sostanze chimiche</td><td>Bilancia elettronica Sartorius, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Colorazione dei funghi</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>Blu anilina</td><td>Colorazione dei funghi</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

La malattia del marciume delle radici secche (DRR) è una minaccia emergente di stress biotico per la coltivazione di ceci in tutto il mondo. È causato da un agente patogeno fungino trasportato dal suolo, Rhizoctonia bataticola. In letteratura, i protocolli completi e dettagliati passo dopo passo sui test delle malattie sono scarsi. Questo articolo fornisce dettagli completi sui passaggi necessari per impostare una tecnica di carta assorbente per vagliare rapidamente i genotipi per la resistenza alla DRR. La tecnica della carta assorbente è facile e meno costosa. Un altro metodo, basato sull'approccio del vaso malato, è un imitatore dell'infezione naturale e può essere applicato per studiare i componenti interagenti - pianta, patogeno e ambiente - coinvolti nel triangolo della malattia.
Inoltre, in natura, la DRR si verifica principalmente nelle aree di coltivazione dei ceci piovosi, dove l'umidità del suolo si allontana con l'avanzare della crescita delle colture. Lo stress da siccità è noto per predisporre le piante di ceci alla malattia DRR. La comprensione patomorfologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità può spianare la strada all'identificazione di varietà resistenti alla DRR d'élite dal pool di germoplasma ceci. Questo articolo fornisce una metodologia graduale per la preparazione di un vaso malato e il successivo saggio di malattia. Nel complesso, le informazioni qui presentate aiuteranno i ricercatori a preparare l'inoculo fungino R. bataticola, mantenere questo agente patogeno, impostare la tecnica della carta assorbente, preparare la coltura malata e il vaso malato e valutare l'infezione da agenti patogeni nelle piante di ceci.

Questo studio mirava a dimostrare tecniche come la carta assorbente e le tecniche del vaso malato per facilitare la comprensione patologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità. Per raggiungere questo obiettivo, le piante che mostravano sintomi DRR1,3,4 sono state raccolte da un campo di ceci e il fungo è stato isolato usando il metodo della punta ifale8. La coltura fu...

Questo studio presenta metodologie per studiare i meccanismi patologici e molecolari alla base dell'interazionececi- Rhizoctonia bataticola. Il metodo della carta assorbente è utile per studiare rapidamente le risposte al genotipo dei ceci, mentre il metodo malato a base di vaso può essere utilizzato per imporre contemporaneamente siccità e infezione da R. bataticola e schermo per genotipi tolleranti.

Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

L'obiettivo principale di questo studio è dimostrare una metodologia dettagliata dei test della malattia del marciume delle radici secche, come la tecnica della carta assorbente e la tecnica del vaso malato. Queste tecniche saranno utili per studiare l'interazione tra pianta di ceci e Rhizoctonia bataticola. Comprendere l'interazione della pianta di ceci con l'agente patogeno fungino Rhizoctonia bataticola è di importanza agricola.Per questo, sono necessari saggi versatili e altamente riproducibili. Qui vengono dimostrati due saggi ampiamente utilizzati nel nostro laboratorio. Uno di questi è a base di carta assorbente, e l'altro è un saggio a base di erba malata.Per eseguire il saggio di carta assorbente, preparare Rhizoctonia bataticola fungus inoculum scalando dalla coltura inclinata alla piastra di Petri e quindi alla coltura liquida. Preparare il vivaio di ceci, seminando semi in una grande pentola. Sradicarli e metterli nell'inoculo liquido e metterli su carta assorbente.Osservare per i sintomi della malattia, vale a dire necrosi sulla radice, marciume radicale e ingiallimento delle foglie otto giorni dopo l'inoculazione. Mostrato qui è un guscio, i passaggi nella tecnica della carta assorbente. Per eseguire il saggio del vaso malato, inoculare il pasto di ceci con il fungo.Dopo l'incubazione a 30 gradi Celsius per 15 giorni, si ottiene una coltura malata. Quindi, polverizzarli e mescolare con il mix di pentole. Semina semi su vaso di controllo e pentola malata.Nei giorni seguenti, osservare i sintomi, vale a dire necrosi sulla radice, marciume radicale e ingiallimento delle foglie sulle piante infette, 10 giorni dopo la semina. Il vaso malato può essere scalato e può essere utilizzato per screening su larga scala. Mostrato qui è un guscio di passaggi nella tecnica del vaso malato.Rhizoctonia bataticola è un agente patogeno in via di sviluppo. Questo fungo produce ife e microsclerotia, che agiscono come inuclum primario durante l'infezione vegetale. La coltura pura che si applica attraverso il metodo isolativo viene utilizzata per i saggi.Il punto chiave per questi test di successo è il carico ottimale dell'inoculo. La dimostrazione della tecnica della carta assorbente inizia qui. Per preparare il liquido Rhizoctonia bataticola inoculum, Inoculare il brodo da 500 ml con il tappo di agar fungino della coltura di piastra fresca di tre giorni e incubare il pallone in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per cinque giorni.Filtrare la micelia fungina grigio scuro con microsclerotia. Sospendere in acqua autoclavata e rimuovere il supporto. Ancora una volta, filtrare la mielia e rimuovere l'umidità asciugando la micelia per alcuni minuti.Sospendere 100 grammi di inoculo fungino in 200 ml di acqua autoclavata in una bottiglia di marmellata e mescolarlo correttamente. Sviluppare vivaio di ceci seminando semi sterilizzati superficiali in solerante. Sradicare le piante otto giorni dopo la semina, lavarle e risciacquarle con RO autoclavato. Prendi una carta assorbente e piegala una volta e posiziona metà di essa sul vassoio.Bagnarlo con acqua autoclavata. Prendere le piante e immergersi nell'inoculo per 30 secondi con movimento intermittente su e giù. Posizionare le piante in modo tale che le radici siano coperte all'interno del foglio e folia rimanga fuori.Piegare l'altra metà e piegare la carta. Per il controllo, immergere le piante in acqua autoclavata, tenere i vassoi in una camera di crescita per otto giorni. Risultati. Osservare per i sintomi come ingiallimento delle foglie, marciume radicale, necrosi nella radice e riduzione del numero di radice laterale.La dimostrazione della tecnica del vaso malato inizia qui. Prendi un chilogrammo di semi di ceci commerciali. Lavare i semi con acqua del rubinetto e lavare di nuovo con l'acqua RO.Immergere i semi per cinque ore. Ancora una volta, lavare i semi con acqua RO aggiungere 300 grammi in una bottiglia di marmellata. Autoclave a 121 LVS per 15 minuti due volte ininterrottamente.Dopo il raffreddamento, trasferire la bottiglia attraverso il flusso laminare. Inoculare le bottiglie con tre tappi di agar fungino di circa quattro millimetri quadrati e scuoterlo bene per mescolare correttamente. Avvolgere le bottiglie e incubarle in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per 15 giorni.Osservare per le bottiglie con crescita miceliale scura intorno ai semi di ceci e rimuovere i semi. Asciugarli a temperatura ambiente e polverizzarli. Mescolare la polvere di Rhizoctonia bataticola con la solorite e conservarle a temperatura ambiente per cinque giorni.La superficie sterilizza i semi GT62 e seminali a una profondità di due centimetri. Risultati. Osservare per il 90% di mortalità in vaso malato. 10 giorni dopo la semina, osservare per i sintomi come la necrosi nelle radici e la riduzione del numero di radici lateralmente e dell'ingiallimento delle foglie nei giorni successivi.La pentola malata può essere preparata anche nel terreno di campo. Siccità e infezione da Rhizoctonia bataticola. Imporre lo stress da siccità nella pentola malata trattenendo l'acqua.Qui sono mostrate le piante sottoposte a controllo, siccità, patogeno e siccità simultanea e stress patogeno. Osservare per i sintomi, vale a dire, più necrosi, marciume radicale e riduzione del numero di radici laterale e lunghezza della radice nel trattamento combinato dello stress rispetto al trattamento solo patogeno. Conclusioni. La tecnica della carta assorbente può essere eseguita in vitro.La tecnica del vaso malato può essere eseguita in condizioni In Vivo. Nel porto malato, lo stress abiotico, vale a dire lo stress da siccità, può essere imposto insieme all'infezione patogena. Usando queste tecniche, si può studiare il modello di infezione patogena.La maggior parte dei cambiamenti fisiologici si verificano durante l'interazione ceci-rhizoctonia bataticola e schermano anche i genotipi di ceci per la resistenza. Il saggio di carta assorbente è molto utile per generare campioni di qualità per studi di microscopia e biologia molecolare. Il saggio del vaso malato, che imita le condizioni naturali di infezione, è applicabile per lo screening del germoplasma dei ceci.

dry-root-rot-disease-assays-in-chickpea-a-detailed-methodology

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La quantificazione della crescita dei patogeni è un potente strumento per caratterizzare varie risposte immunitarie di Arabidopsis thaliana (di seguito: Arabidopsis). Il metodo qui descritto presenta un saggio di infiltrazione a siringa ottimizzato per quantificare il pv di Pseudomonas syringae. maculicola ES4326 crescita nelle foglie adulte di Arabidopsis.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

La cellulosa cristallina è un importante costituente della parete cellulare delle piante. Tuttavia, la sua quantificazione a una risoluzione cellulare è tecnicamente impegnativa.  Qui, riportiamo l'uso della tecnologia della luce polarizzata e delle sezioni trasversali delle radici per ottenere informazioni sulla composizione della parete cellulare con una risoluzione spazio-temporale.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Il sistema di cocultivazione idroponico descritto supporta piante intatte con schermi a maglie metalliche e cocultivala con batteri. I tessuti vegetali, i batteri e le molecole secrete possono quindi essere raccolte separatamente per analisi a valle, consentendo contemporaneamente le risposte molecolari di entrambi gli host vegetali e dei microbi o dei microbiomi interattivi.

Un sistema di co-coltivazione idroponica per l&#39;analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

Un protocollo per l'analisi di un concorso di piastra identificare se un compost specifico è probabile contenere batteri e funghi che sopprimono la crescita di Rhizoctonia solaniè presentato.

Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

La gestione dell'appassimento del Fusarium dell'anguria richiede la conoscenza delle razze patogene presenti. Qui, descriviamo il root-dip, la semina del kernel infestato e i metodi di inoculazione a immersione del vassoio modificati per dimostrare la loro efficacia nella tipizzazione della razza del fungo patogeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Un contrasto di tre tecniche di inoculazione utilizzate per determinare la razza di Fusarium oxysporum sconosciuto f.sp. niveum Isola

Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.

Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l'architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.

Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante

Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Scopri le tecniche di carta assorbente e vaso infetto per analizzare l'interazione tra ceci e Rhizoctonia bataticola. Questi metodi permettono di studiare i meccanismi di infezione fungina e valutare la tolleranza delle piante.

Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Esplora altri video