Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse
25 giugno 2021
Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.
Questo protocollo combina l'ibridazione in situ dell'RNAscope a fluorescenza e l'immunoistochimica utilizzando preparati cerebrali freschi o fissi. Questa tecnica consente flessibilità dimostrando una combinazione di metodi di ibridazione in situ altamente sensibili e immunoistochimica per la visualizzazione spaziale di bersagli di RNA e proteine nello stesso campione di tessuto. Questo metodo è applicabile per la marcatura multiplex nella sezione del tessuto cerebrale, aiutando lo studio dell'organizzazione spaziale e del significato funzionale dell'mRNA e delle proteine all'interno di popolazioni neuronali eterogenee nelle neuroscienze.
Questo protocollo si concentra principalmente sulle fasi di lavorazione del tessuto fresco congelato e del tessuto fissato con paraformaldeide. Per iniziare a sezionare il tessuto cerebrale appena congelato, fissarlo al mandrino del criostato pre-raffreddato e tagliare sezioni coronali spesse 14 micrometri. Montare la sezione su un vetrino per microscopia caricato.
Trasferire il vetrino montato in una scatola per vetrini. Quindi trasportare la scatola nel congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco. Per la fissazione dei tessuti, filtrare la soluzione di paraformaldeide preparata.
Raffreddare a 4 gradi Celsius. Portare il vetrino montato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio secco e immergerlo immediatamente nella soluzione di paraformaldeide pre-raffreddata per 15 minuti, eseguire la disidratazione del tessuto fresco-congelato per garantire che il vetrino sia completamente asciutto. Dopo aver rimosso il cervello da un supporto fisso a profusione transcardica, utilizzando un microtomo vibrante, tagliare sezioni di tessuto spesse 30 micrometri.
Conservare le sezioni tagliate in una soluzione crioprotettiva. Il giorno del test FISH, trasferire la sezione flottante in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti contenente PBS molare da 0,1 e agitarla a 90-100 giri/min su un agitatore a piattaforma rotante per lavare via il crioprotettore. Quindi, utilizzando un pennello, montare la sezione in piano su un vetrino per microscopia per evitare che si stacchi durante i lavaggi e asciugare all'aria per almeno due ore.
Utilizzando una penna barriera idrofoba, disegnare una barriera idrofobica attorno alla sezione per contenere i reagenti FISH. Dopo la pre-lavorazione, il tessuto viene incubato in soluzione di proteasi e ibridato con sonde RNAscope per due ore secondo le linee guida del produttore. Successivamente, vengono eseguite le fasi di amplificazione sequenziale e l'immunoistochimica a fluorescenza.
Iniziare preparando una camera umidificata protetta dalla luce per l'incubazione dei vetrini. A bagnomaria, riscaldare il tampone di lavaggio 50X e sonde a 40 gradi Celsius per 10 minuti. Una volta raffreddato a temperatura ambiente, preparare un litro di tampone di lavaggio 1X dalla concentrazione di 50X.
Preparare la miscela della sonda come descritto nel manoscritto del testo. Per il trattamento con proteinasi, aggiungere proteinasi 3 alla sezione di tessuto e incubarla a temperatura ambiente per 30 minuti. Per lavare via la proteinasi, immergere delicatamente il vetrino in PBS 0,1 molare a temperatura ambiente, evitando lo spostamento della sezione.
Per l'ibridazione, aggiungere la miscela della sonda alla sezione del tessuto. Metterlo nella camera umidificata preriscaldata. Quindi incubarlo per due ore a 40 gradi Celsius.
Sciacquare la sezione di tessuto con tampone di lavaggio due volte per due minuti. Per l'amplificazione del segnale, utilizzando un flacone contagocce, aggiungere una soluzione di amplificazione per coprire la sezione tissutale e incubare come descritto nel testo. Aggiungere la soluzione bloccante alla sezione di tessuto e incubare per un'ora a temperatura ambiente per evitare legami non specifici.
Muovere il vetrino per rimuovere il tampone bloccante in eccesso dopo l'incubazione. Ora, incubare la sezione con anticorpi primari per una notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare il vetrino tre volte con 1X TBS.
Aggiungere l'anticorpo secondario e incubare le sezioni per due ore a temperatura ambiente. Esaminare il vetrino con un microscopio a epifluorescenza dotato di telecamera. Acquisisci immagini rappresentative con un ingrandimento di 20 volte e salvale come file TIF.
Nel presente studio, la qualità del tessuto, l'integrità e l'assenza di contaminazione batterica sono state confermate dall'assenza di etichettatura DAPI. La marcatura delle sonde di controllo positivo che hanno come bersaglio l'ubiquitina C, la peptidilprolil isomerasi B e l'mRNA della RNA polimerasi IIA hanno confermato l'integrità dell'RNA. Nelle preparazioni fresche congelate per distinguere i neuroni positivi all'mRNA GalR1 all'interno dell'NTS, sono stati utilizzati ulteriori marcatori neurochimici.
Il trasportatore vescicolare legato alla membrana è stato chiaramente etichettato. Al contrario, le proteine citoplasmatiche come la tirosina idrossilasi e la GFP espresse sotto il controllo del promotore PHOX2B sono state debolmente osservate e descritte come flocculanti in quanto prive di un contorno chiaro. La marcatura dell'mRNA citoplasmatico di GalR1 con sonda FISH GalR1 è stata punteggiata e osservata chiaramente.
Per confermare che la qualità dell'immunoistochimica dipende dalla localizzazione subcellulare delle proteine, diverse proteine nucleari e citoplasmatiche sono state marcate in parallelo con FISH nelle stesse sezioni di tessuto. La GFP citoplasmatica PHOX2B aveva un aspetto flocculante. Mentre il segnale della proteina nucleare PHOX2B era chiaro, il che ha confermato un'immunomarcatura di qualità superiore quando combinata con FISH.
Quando è stata eseguita su sezioni fisse congelate in combinazione con FISH, l'immunoistochimica si è dimostrata affidabile indipendentemente dalla localizzazione subcellulare. I neuroni positivi all'mRNA GlyT2 erano localizzati ventralmente all'NTS e non all'interno dell'NTS. I neuroni positivi all'mRNA GlyT2 e positivi all'mRNA PHOX2B non si sono colocalizzati.
Una sottopopolazione di neuroni NTS positivi all'mRNA PHOX2B era immunoreattiva della tirosina idrossilasi e nessuno conteneva mRNA GlyT2. RNAscope consente la visualizzazione e l'analisi della distribuzione dell'RNA alla risoluzione di una singola molecola nelle cellule e nei tessuti. Potenzia la ricerca su nuove specie di RNA, meccanismi di malattia, modelli di espressione genica, diversità dei neuroni e interazioni cellulari.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per combinare l'ibridizzazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) su sezioni di cervello di topo fresche e congelate e fissate. La tecnica permette la visualizzazione spaziale di bersagli RNA e proteici simultaneamente, aiutando nell'indagine delle popolazioni neuronali.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia molecolare
- Immunoistochimica
Sfondo
- Lo studio indaga l'organizzazione spaziale di mRNA e proteine in popolazioni neuronali eterogenee.
- Combinare FISH e IHC permette l'etichettatura multipla nelle sezioni di tessuto cerebrale.
- Mira a migliorare la comprensione dell'espressione genica e della localizzazione proteica nel cervello.
- Il protocollo è applicabile sia a tessuti freschi-congelati che fissati con paraformaldeide.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile e flessibile di rilevazione simultanea di RNA e proteine.
- Migliorare l'indagine sulla distribuzione dell'mRNA e sulla localizzazione delle proteine nelle cellule neuronali.
- Validare la qualità dell'etichettatura immunoistochimica quando combinata con FISH.
Metodi utilizzati
- Sono state utilizzate sezioni di cervello fresche-congelati e fissati con paraformaldeide come piattaforma principale.
- Il modello biologico ha coinvolto il tessuto cerebrale di topo, concentrandosi sui segnali RNA e proteici nei neuroni.
- Il metodo include passaggi critici come sezionamento, fissazione, ibridizzazione e amplificazione del segnale.
- Sono stati seguiti protocolli dettagliati di incubazione e lavaggio per garantire risultati chiari.
Risultati principali
- Le sonde di controllo positivo hanno confermato l'integrità dell'RNA, mentre sono stati osservati vari gradi di chiarezza del segnale nelle proteine.
- Lo studio ha dimostrato la capacità di differenziare tra segnali citoplasmatici e nucleari nei neuroni.
- Sono state riportate indicazioni di distinte popolazioni neuronali e le loro espressioni RNA/proteine.
- La combinazione di FISH e IHC si è rivelata affidabile per visualizzare molteplici bersagli nelle stesse sezioni.
Conclusioni
- Il protocollo permette un'esplorazione avanzata della diversità neuronale e dell'interazione all'interno del tessuto cerebrale.
- Questo studio fornisce una struttura per future indagini sui meccanismi neuronali e potenziali modelli di malattia.
- Il metodo arricchisce la nostra comprensione delle dinamiche molecolari e cellulari nella neuroscienza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Combining multiplex FISH with fluorescence IHC enables biopharma R&D to resolve spatial co-expression of RNA and protein targets within heterogeneous neuronal populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. This approach enhances predictive confidence by linking molecular signatures to cellular phenotypes, informing go/no-go decisions in early discovery. The method’s applicability to fresh-frozen and fixed tissues provides workflow flexibility for target interrogation across preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping low-abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high-abundance transcripts within immunohistochemically defined brain nuclei.
- Operational Value: Supports biological de-risking through concurrent RNA-protein labeling, clarifying target engagement and pathway modulation in neuronal circuits.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing neuronal subpopulations based on neurochemical signatures, reducing ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by confirming RNA integrity via positive control probes (ubiquitin C, peptidylprolyl isomerase B, RNA polymerase IIA).
- Operational Value: Enables assay standardization through optimized protease incubation and hybridization conditions, improving reproducibility across fresh-frozen and fixed tissue preparations.
- Scalability Value: Supports platform reuse for multiplex RNA-protein detection, aiding reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances translational biomarker alignment by visualizing spatial organization of mRNA and protein expression in disease-relevant brainstem nuclei (e.g., NTS).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining IHC quality post-FISH, particularly for membrane-bound targets.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decision-making by revealing lack of colocalization between GlyT2 mRNA-positive and PHOX2B mRNA-positive neurons, refining mechanistic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling spatial validation of molecular targets in neuronal populations prior to phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving RNA distribution within immunohistochemically identified neurons, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized FISH-IHC workflows, ensuring reproducible spatial readouts for compound response evaluation.
- Analytics: Generates quantitative spatial data via fluorescence signal detection, enabling comparison of RNA and protein expression levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating target expression in fixed tissue preparations, supporting biomarker-aligned disease modeling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable spatial profiling capability across neuroscience discovery programs, maximizing infrastructure investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through direct visualization of RNA-protein co-expression, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via optimized protease and hybridization steps, minimizing variability in multiplex labeling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through subcellular resolution, reducing late-stage attrition due to biological mismatch.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying neuronal subpopulations with distinct RNA-protein profiles, informing indication selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, RNA probe handling, and antibody optimization to manage signal specificity.
- Dependent on RNase-free environments, cryostat or microtome sectioning tools, and fluorescence imaging systems with appropriate filter sets.
- Necessitates cross-team standardization of protease incubation times and antibody validation protocols to ensure consistent IHC quality post-FISH.
- Requires adaptation based on protein subcellular localization, as cytoplasmic targets may need extensive troubleshooting while membrane-bound proteins show retained specificity.
- Limited by tissue handling challenges in fixed-frozen preparations, though IHC quality is superior when optimized with RNAscope.
