Name: Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri come valutare la trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane in vitro. Questo metodo integra saggi di proliferazione, crescita indipendente dall'ancoraggio e colture 3D per analizzare il comportamento cellulare.

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Il laboratorio AG è finanziato dal Consiglio spagnolo per la sicurezza nucleare. T.A. e A.G. sono membri di un gruppo di ricerca riconosciuto dalla Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT ha un contratto finanziato dalla Fondazione Scientifica Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Il contratto G.F. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione Cellex.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli sperimentali descritti in questo documento forniscono strumenti utili per valutare la trasformazione oncogenica delle cellule coltivate in vitro. Ogni tecnica valuta aspetti specifici del processo di trasformazione e, pertanto, occorre prestare particolare attenzione quando si vengono tratte conclusioni da una singola analisi. L'accumulo di curve di crescita è un approccio che richiede informazioni già disponibili quando si coltivano cellule per altri scopi. Ciò rende questa tecnica più economica e più facil...

Sono necessari più eventi successivi per lo sviluppo della neoplasia. Nel 2011, Hanahan e Weinberg hanno descritto 10 capacità che consentono la crescita, la sopravvivenza e la diffusione delle cellule trasformate: i cosiddetti "Hallmarks of Cancer"1. La metodologia qui descritta compila tre diversi strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro concentrandosi su alcune delle caratteristiche distintive delle cellule tumorali. Queste tecniche valutano il tasso di proliferazione cellulare, il comportamento delle cellule quando coltivate in 3D e la loro capacità di formare colonie con indipendenza di ancoraggio.
I modelli cellulari sono fondamentali per testare l'ipotesi in vitro. Diversi approcci sono stati sviluppati per generare modelli sperimentali di trasformazione cellulare per lo studio del cancro2,3,4. Poiché il cancro al seno è il cancro più comune tra le donne in tutto il mondo ed è responsabile di circa il 15% dei decessi per cancrotra le donne 5, fornire modelli cellulari adatti di cellule epiteliali mammarie è della massima importanza per ulteriori indagini. In questo articolo, abbiamo illustrato il potenziale di tre tecniche per valutare la trasformazione cellulare utilizzando un modello sperimentale di trasformazione delle cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) inizialmente descritto da Ince e colleghi nel 20076 e successivamente implementato nel nostro laboratorio7. Questo modello sperimentale si basa sull'alterazione sequenziale di tre geni mirati (SV40 Large T e piccoli antigeni t qui indicati come Ttag, hTERTe HRAS) al genoma dei BPEC non trasformati. Inoltre, il metodo utilizzato per la derivazione dei BPEC favorisce il mantenimento di cellule epiteliali mammarie con marcatori luminali o mioepiteliali, risultando in una coltura cellulare eterogenea che conserva alcuni dei tratti fisiologici della ghiandola mammaria.
Nella ghiandola mammaria, le cellule epiteliali mammarie luminali, che sono responsabili della produzione di latte, si trovano vicino al lume, mentre le cellule mioepiteliali vengono smaltite intorno alle cellule luminarie e si prendono cura dei movimenti di contrazione che portano il latte al capezzolo. La perdita di una corretta organizzazione tra questi lignaggi cellulari è una caratteristica dellatrasformazione tumorale 8 che può essere valutata in vitro dopo il rilevamento immunofluorescente di marcatori di lignaggio distintivi nelle colture cellulari 3D. Un'altra caratteristica importante delle cellule tumorali è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare1. Quando le cellule sane sono costrette a crescere in sospensione, meccanismi come anoikis \u2012 un tipo di morte cellulare indotta in risposta al distacco dalla matrice extracellulare \u2012vengono attivati 9. L'evasione della morte cellulare è uno dei tratti distintivi del cancro e quindi, le cellule trasformate sono in grado di inattivare l'anoikis e sopravvivere in modo indipendente dall'ancora. Questa capacità può essere valutata in vitro con il saggio indipendente dall'ancoraggio utilizzando l'agar morbido. Inoltre, una caratteristica intrinseca dei tessuti tumorali è la loro capacità di segnalazione proliferativa sostenuta, che può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro misurando l'aumento del numero di cellule nel tempo, non solo nei test di sospensione ma anche monitorando il tasso di crescita delle colture aderenti monostrato.
Nonostante il miglior modello per testare il potenziale tumorigenico sia l'inoculazione delle cellule tumorali nei modelli murini e la valutazione dello sviluppo tumorale in situ, è importante ridurre al minimo il più possibile il numero di animali impiegati nelle procedure sperimentali. Pertanto, avere test adeguati per valutare la trasformazione in vitro è una priorità assoluta. Qui, forniamo una serie di strumenti per valutare il potenziale tumorigenico delle cellule epiteliali del seno parzialmente e completamente trasformate che possono essere facilmente implementate nella maggior parte dei laboratori che lavorano con modelli di trasformazione cellulare.

<table><tbody><tr><td>1 ml di pipette sierologiche</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml di Eppendorfs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>Gli eppendorf scuri sono preferiti per la conservazione a lungo termine MTT</td></tr><tr><td>10 &mu; l Puntali per pipette senza filtro</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr>Flacone <td></td><td></td><td>in vetro da 100 ml</td><td>Con tappo, autoclavabile</td></tr><tr><td>1000 &mu; l Puntali per pipette con filtro</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; l Puntali per pipette senza filtro</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Provette coniche</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipette sierologiche</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Puntali per pipette con filtro</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 5 ml</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>Utilizzato per la fissazione della struttura 3D prima della marcatura con immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Utilizzato per il test di ancoraggio</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Claudina 4</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID:AB_301650</td><td>Diluizione di lavoro 1:100, ospite: coniglio</td></tr><tr><td>Anti-Citocheratina 14 [RCK107] anticorpo</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID:AB_307087</td><td>Diluizione di lavoro 1:100, ospite: topo</td></tr><tr><td>Anti-topo Anti-cianonina Cy3 anticorpo</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Diluizione di lavoro 1:500, ospite: capra</td></tr><tr><td>Anti-coniglio Alexa Fluor 488 anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Diluizione di lavoro 1:500, ospite:</td></tr><tr><td>autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di capra BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare a 24 pozzetti Plate</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>Utilizzato per le colture 3D in Matrigel. Coltura cellulare a fondo piatto</td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>Plate Labclinics</td><td>PLC30006</td><td>Utilizzato per il saggio di ancoraggio</td></tr><tr><td>Incubatore cellulare (37 &ordm; C e 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>Dimensioni della maglia: 40 &mu; m</td></tr><tr><td>Software CellSense</td><td>Olympus</td><td></td><td>Utilizzato per l'acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colera Tossina da Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Utilizzato per integrare il terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe II</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, spessore 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-amidinofenil)-1H -indolo-6-carbossamidina</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino Biowest</td><td></td><td>S1810</td><td>Utilizzato per inattivare l'azione della tripsina</td></tr><tr><td>Software Fiji (ImageJ)</td><td>National Institutes of Health</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Download gratuito, nessuna licenza necessaria</td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur Vetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td></td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D</td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td> resistenti al calore <td>Utilizzato per la manipolazione dell'agar dopo l'autoclave</td></tr><tr><td>Bagno riscaldante (37 &ordm; C)</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per temperare le soluzioni prima della subcoltura cellulare</td></tr><tr><td>Bagno riscaldante (42 &ordm; C)</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per mantenere caldo l'agar</td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td> riscaldante <td>Utilizzato per la disidratazione del Matrigel</td></tr><tr><td>Camera umida</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per l'incubazione degli anticorpi durante l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td>Utilizzato durante la manipolazione del Matrigel</td></tr><tr><td>Ghiacciaia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico invertito</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>negozio a -20 &ordm; C e mantenere il freddo durante l'uso. Indicato come matrice della membrana basale</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>Utilizzato per la fissazione 3D della struttura prima della marcatura immunofluorescente</td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 e p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Utilizzato per calcolare il raddoppio della popolazione e per ottenere l'equazione del tasso di crescita</td></tr><tr><td>MilliQ acqua</td><td></td><td></td><td>Indicato come acqua ultrapura</td></tr><tr>Smalto <td></td><td></td> per<td>unghie</td><td>Utilizzato per sigillare i campioni dopo il montaggio</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Utilizzato per coprire la soluzione anticorpale durante l'incubazione</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (senza calcio e magnesio)</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Sterile. Utilizzato per la subcoltura cellulare</td></tr><tr><td>Compresse PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Diluire in acqua milliQ. Non è richiesta alcuna sterilità. Utilizzato per l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 fiasche</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>Utilizzato per la coltura BPEC</td></tr><tr><td>Scettro Contatore cellulare automatizzato</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>In alternativa, utilizzare un emocitometro</td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per tagliare i puntali delle pipette e il parafilm</td></tr><tr><td>Filtri sterili 0,22 &; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Utilizzato per filtrare la soluzione MTT</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>Conservare a -20 &ordm; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 10X</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>Diluire in PBS per ottenere la soluzione 3X</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Mounting Medium Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC Culture</td><td>Medium Stemgent</td><td>00-0051</td><td>Utilizzato per la coltura primaria di BPIC</td></tr><tr><td>WIT-T Terreno di coltura</td><td>Stemgent</td><td>00-0047</td><td>Utilizzato per la coltura BPEC trasformata</td></tr></tbody></table>

valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

La tumorigenesi è un processo in più fasi in cui le cellule acquisiscono capacità che consentono la loro crescita, sopravvivenza e diffusione in condizioni ostili. Diversi test cercano di identificare e quantificare questi tratti distintivi delle cellule cancerose; tuttavia, spesso si concentrano su un singolo aspetto della trasformazione cellulare e, di fatto, sono necessari più test per la loro corretta caratterizzazione. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire ai ricercatori una serie di strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro da un'ampia prospettiva, consentendo così di trarre conclusioni valide.
Un'attivazione prolungata della segnalazione proliferativa è la caratteristica principale dei tessuti tumorali e può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro calcolando il numero di raddoppi della popolazione raggiunti nel tempo. Inoltre, la crescita delle cellule nelle colture 3D consente la loro interazione con le cellule circostanti, simile a ciò che accade in vivo. Ciò consente la valutazione dell'aggregazione cellulare e, insieme all'etichettatura immunofluorescente di marcatori cellulari distintivi, di ottenere informazioni su un'altra caratteristica rilevante della trasformazione tumorale: la perdita di una corretta organizzazione. Un'altra caratteristica notevole delle cellule trasformate è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare, che può essere valutata con il saggio di ancoraggio.
Vengono fornite procedure sperimentali dettagliate per valutare il tasso di crescita cellulare, per eseguire l'etichettatura immunofluorescente dei marcatori di lignaggio cellulare nelle colture 3D e per testare la crescita delle cellule indipendenti dall'ancoraggio nell'agar morbido. Queste metodologie sono ottimizzate per le cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) a causa della sua rilevanza nel cancro al seno; tuttavia, le procedure possono essere applicate ad altri tipi di celle dopo alcune regolazioni.

Un modello sperimentale di trasformazione cellulare con l'introduzione di tre elementi genetici nei BPEC è stato scelto per generare risultati rappresentativi della trasformazione oncogenica6,7 (Figura 3). I BPEC non trasformati(N)sono stati derivati da tessuti mammari indenne da malattie come descritto dall'Incee dai colleghi 6 e coltivati secondo il protocollo qui indicato. Dopo ave...

Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Questa metodologia utilizza l'integrazione di diversi indicatori per valutare il grado di trasformazione di qualsiasi modello cellulare. Questa tecnica fornisce ai ricercatori una serie di strumenti dispendiosi in termini di tempo ma semplici da usare per valutare la trasformazione cellulare in vitro. Ciò consente di utilizzare il metodo nella maggior parte dei laboratori.A dimostrare la procedura saranno Teresa Anglada, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio, e Joan Repulles, una specialista in microscopia. Quando la coltura di cellule epiteliali primarie del seno raggiunge il 90% di confluenza, trasferire il surnatante dal pallone di coltura in una provetta da 15 millilitri contenente due millilitri di siero fetale bovino e lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con un millilitro di tripsina per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Quando le cellule si sono staccate, inattivare la tripsina con il terreno riservato e raccogliere le cellule per centrifugazione. Muovi il tubo per risospendere il pellet e aggiungi da uno a due millilitri di terreno fresco per il conteggio. Dopo aver determinato la concentrazione cellulare, aggiungere 300.000 cellule in una nuova provetta e portare il volume finale a cinque millilitri con ulteriore terreno di coltura fresco.Seminare le cellule in un nuovo pallone T25 e rimetterle nell'incubatore per colture cellulari. Quindi usa la formula per calcolare il numero di raddoppi della popolazione accumulati. Per valutare il tasso di proliferazione delle cellule, tracciare il numero accumulato di raddoppi della popolazione per un intervallo di tempo specifico.Una pendenza maggiore indica un aumento del tasso di proliferazione cellulare. Per allestire una coltura cellulare 3D, sciacquare i pozzetti con una superficie di 1,9 centimetri quadrati con PBS sterile freddo e rivestire il fondo di ciascun pozzetto con 100 microlitri di matrice di membrana basale. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per circa 20 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi.Nel frattempo, raccogliere le cellule mammarie come appena dimostrato e diluire le cellule a una concentrazione media di 400.000 cellule per millilitro. Mescolare le cellule con terreno fresco integrato con matrice di membrana basale all'8% in un rapporto uno a uno e aggiungere 500 microlitri di cellule a ciascun pozzetto di matrice solidificata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per alcuni minuti, quindi aggiungere 500 microlitri di terreno integrato con matrice di membrana basale al 4% in ciascun pozzetto.Mettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari per 14 giorni. Le cellule seminate si raggrupperanno e prolifereranno formando strutture simili agli acini. Per la rilevazione di proteine immunofluorescenti nelle cellule mammarie coltivate in 3D, utilizzare una punta di pipetta P200 cutoff per rimuovere la matrice della membrana basale da ciascun pozzetto e spalmare circa 50 microlitri di matrice disaggregata da ciascun pozzetto su singoli vetrini.Quando i campioni si sono completamente asciugati, fissare le cellule con una soluzione uno-a-uno di metanolo-acetone a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo il fissaggio, bloccare i campioni con una soluzione bloccante per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri della soluzione di lavoro dell'anticorpo primario di interesse e coprire i vetrini con una striscia di pellicola da laboratorio per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius in una camera umida.La mattina successiva, lavare i vetrini tre volte con PBS per un'ora per lavaggio ed etichettare i campioni con la soluzione di anticorpi secondari appropriata, come appena dimostrato. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte in PBS per due ore per lavaggio prima di controcolorarli con DAPI diluito in terreno di montaggio anti-sbiadimento e coprire ogni vetrino con un vetrino coprioggetti. Quindi analizza la distribuzione del segnale fluorescente per ciascun acino su un microscopio confocale.Per eseguire un saggio indipendente dall'ancoraggio, coprire prima il fondo del numero appropriato di pozzetti di una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri di agar allo 0,6% in soluzione media e lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione da cinque volte 10 a una quarta cellula per millilitro come dimostrato e filtrare le cellule attraverso un colino da 40 micron in una provetta sterile da 50 millilitri. Tenendo la provetta a un angolo di 45 gradi, aggiungere un volume uguale di agar allo 0,6% in soluzione media lungo la parete della provetta.E dopo un'accurata miscelazione, sovrapporre un millilitro di cellule in sospensione di agar a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti precedentemente preparata. Utilizzare un microscopio invertito per confermare che le cellule siano state disperse in modo omogeneo in tutto l'agar. Quando l'agar si è completamente solidificato, aggiungere con cura un millilitro di terreno di coltura rinfrescante a ciascun pozzetto senza disturbare l'agar e incubare le cellule per tre settimane, cambiando il terreno due volte a settimana.Al termine del periodo di formazione della colonia, sostituire il terreno con un millilitro di un milligrammo per millilitro MTT per pozzetto per un'incubazione di 24 ore nell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, rimuovere l'MTT da ciascun pozzetto e acquisire le immagini di ciascun pozzetto sul microscopio invertito. Una volta acquisite tutte le immagini, aprire le immagini in ImageJ e fare clic su immagine, regola, soglia e applica per ottenere una maschera binaria tramite la soglia dell'immagine originale.Quando sono state ottenute colonie ben delimitate, selezionare i plug-in e il biovoxxel per avviare l'analizzatore di particelle esteso per identificare le colonie MTT-positive. In un intervallo di tempo specifico, le cellule parzialmente e completamente trasformate raggiungono un numero maggiore di raddoppi della popolazione rispetto alle cellule non trasformate, indicando che il tasso di divisione cellulare aumenta con il processo di trasformazione. Durante il periodo di coltura cellulare 3D di due settimane, le cellule si aggregano e proliferano, aumentando le dimensioni degli acini.La corretta polarizzazione di ciascun acino può essere valutata con precisione utilizzando la rilevazione immunofluorescente delle proteine in combinazione con la localizzazione tridimensionale del segnale mediante microscopia confocale. Mentre tutti gli acini formati da cellule mammarie non trasformate sono adeguatamente organizzati, si osserva una perdita di polarizzazione negli acini formati da cellule parzialmente e completamente trasformate. Dopo tre settimane di coltura di agar incorporata, le cellule con una capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio danno origine a colonie composte da più cellule.Solo le cellule metabolicamente attive sono in grado di scindere l'anello MTT del tetrazolio, dando luogo alla formazione di cristalli di formazan MTT viola dopo 24 ore. La misurazione del diametro della colonia mediante analisi automatica delle immagini consente il filtraggio di colonie a bassa proliferazione o di singole cellule. Il numero di colonie formate da cellule non trasformate è trascurabile rispetto a quelle provenienti da cellule parzialmente e completamente trasformate.La dimensione della colonia può anche essere utilizzata per discriminare tra cellule con diversi gradi di trasformazione. Questi saggi possono essere utilizzati per lo screening di linee cellulari prima di qualsiasi inoculazione, poiché solo le linee cellulari che sono risultate positive in vitro devono essere inoculate nei topi.

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In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.

Trapianto mammaria di cellule stromali e cellule di carcinoma in topi C57BL/6J

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi.  Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l'invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Il presente protocollo descrive l'iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

Scopri come valutare la trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane in vitro. Questo metodo integra saggi di proliferazione, crescita indipendente dall'ancoraggio e colture 3D per analizzare il comportamento cellulare.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

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