Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)
27 ottobre 2020
A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.
Questo protocollo è significativo in quanto fornisce un metodo per misurare e visualizzare i segnali FRET o AMP ciclici in tre dimensioni spaziali in singole cellule. Le distribuzioni AMP cicliche possono verificarsi assialmente oltre che lateralmente ed è importante acquisire i dati dell'immagine AMP ciclica FRET in tre dimensioni per campionare queste distribuzioni. Il giorno dell'imaging, il tampone caldo di Tyrodes a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua e monta un vetrino coprioggetti posizionato con le cellule trasfettate di interesse in una camera cellulare.
Fissare la parte superiore della camera con una guarnizione di montaggio per evitare perdite e utilizzare un tergicristallo delicato per rimuovere il fluido in eccesso o le celle aderenti dalla parte inferiore del vetrino coprioggetto. Aggiungere 800 microlitri di tampone di lavoro e quattro microlitri di etichetta nucleare da cinque millimolari alla camera cellulare e far oscillare delicatamente la camera per cinque-10 secondi. Quindi coprire la camera cellulare con un foglio di alluminio per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.
Per visualizzare le cellule, selezionare l'obiettivo a immersione in acqua 60X su un microscopio confocale dotato di un rivelatore spettrale e aggiungere una goccia d'acqua all'obiettivo. Posizionare la camera della cella caricata sul tavolino del microscopio e regolare la manopola del filtro per selezionare il set di filtri appropriato. Selezionare la modalità a campo largo a fluorescenza e selezionare con gli oculari un campo visivo contenente le celle che esprimono il sensore AMP ciclico FRET.
Aprire il software di imaging, selezionare la modalità confocale e sbloccare il pulsante di interblocco laser. Apri il menu delle impostazioni A1. Seleziona le caselle corrispondenti alle linee laser a 405 e 561 nanometri e imposta queste rilevazioni spettrali su SD, la risoluzione su 10 e i canali su 32.
Selezionare i valori della lunghezza d'onda iniziale e finale per impostare l'intervallo di lunghezze d'onda. Apri il menu Impostazioni A1 per selezionare l'icona di salto del binning. Selezionare la casella del numero 15 e fare clic su OK. Impostare l'intensità del laser all'otto percento per il laser a 405 nanometri e al due percento per il laser a 561 nanometri.
Impostare il guadagno del rivelatore su 149 e il raggio del foro stenopeico su 2,4 unità disco Airy. Impostare la velocità di scansione su 25 fotogrammi spettrali al secondo e selezionare la direzione di scansione unidirezionale. Impostare il conteggio su quattro e la dimensione della scansione su 1024 per 1024.
Per definire i parametri di acquisizione z-stack, fare clic su Visualizza, Controllo acquisizione e Acquisizione ND e immettere la destinazione e il nome del file nella finestra pop-up per salvare il file ND. Fare clic sulla casella z-series e fare clic su Live nella finestra Impostazioni A1 Plus per aprire una finestra di visualizzazione dal vivo. Regola la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le celle mentre guardi nella finestra di anteprima.
Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte superiore della cella e fare clic su Superiore nella finestra di acquisizione ND per impostare la posizione corrente come superiore. Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte inferiore della cella e fare clic su Inferiore per impostare la posizione corrente come inferiore. Immettere un micrometro per la dimensione del passo.
Selezionare In alto in basso per la direzione di scansione z e fare clic su Esegui per acquisire uno z-stack. Quando l'acquisizione z-stack è completa, utilizzare una pipetta per aggiungere delicatamente il reagente di interesse alla camera senza disturbare le cellule. Dopo 10 minuti, modificare il nome del file e acquisire una seconda immagine z-stack.
Dopo l'imaging, creare nuove cartelle con gli stessi nomi di file delle immagini spettrali z-stack e aprire il file di immagine spettrale di interesse. Fare clic su File, Importa/Esporta ed Esporta documento ND. Nella finestra pop-up, seleziona la cartella appena creata, TIFF per il tipo di file, immagine mono per ciascun canale e mantieni profondità di bit.
Fare clic su Esporta per esportare i singoli file nella cartella e aprire il software di smistamento spettrale lineare. Aprire l'unmixing lineare. m e fare clic su Esegui.
Sfogliare e selezionare la cartella contenente la sequenza di file TIFF esportata e fare clic su OK per aprire la finestra della lunghezza d'onda e della z-slice. Copiare il nome del file del primo file senza la z-slice e il numero del canale dalla cartella e incollarlo nel primo passaggio della casella Invio del nome immagine, immettere il numero di canali nella casella Immettere il numero di bande di lunghezza d'onda e il numero di z-slice nella casella Immettere il numero di Z Slices e fare clic su OK. Quindi, nella finestra pop-up, sfoglia e seleziona la lunghezza d'onda. mat e fare clic su Apri.
Sfoglia e seleziona il file Library. mat nella nuova finestra pop-up e fai nuovamente clic su Apri per avviare l'unmixing della sezione. Per calcolare l'efficienza FRET, aprire il multiFRRCF.
m e inserire il numero di prove sperimentali da analizzare nella casella Quante cartelle ritagliare. Fare clic su OK. Sfogliare per selezionare le cartelle non mescolate e fare nuovamente clic su OK. Nella nuova finestra pop-up, imposta il fattore di scala su 12,4, la soglia su 56, la frequenza X, Y e Z rispettivamente su cinque, cinque e uno e l'algoritmo di livellamento su Gaussiano.
Quindi fare clic su Esegui per eseguire le misurazioni FRET e il relicing. Per mappare l'efficienza FRET ai livelli di AMP ciclico, aprire il Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m e fare clic su Esegui.
Individuare e selezionare la prima immagine FRET in scala di grigi e fare clic su OK. Quindi aprire le immagini AMP cicliche FRET per ispezionare la distribuzione dei segnali AMP ciclici in tre dimensioni. In queste immagini si possono osservare viste tridimensionali di dati di immagini iperspettrali grezze a colori falsi acquisiti utilizzando la microscopia confocale al basale e 10 minuti dopo il trattamento con forskolina . In questa analisi, un fluoroforo accettore è stato completamente fotodistrutto consentendo di ottenere firme spettrali del donatore e dell'accettore con stechiometria uno-a-uno.
Cellule non trasfettate marcate con un colorante nucleare sono state utilizzate per ottenere lo spettro puro del fluoroforo colorante. La combinazione degli spettri dei fluorofori del donatore, dell'accettore e del colorante nucleare consente la creazione di una libreria a tre componenti. Qui si possono osservare le sorgenti di tre firme spettrali di fondo.
Sebbene questi segnali siano distribuiti in modo non uniforme all'interno del campione e non possano essere semplicemente sottratti, l'aggiunta delle firme spettrali di questi segnali alla libreria spettrale e l'utilizzo del missaggio lineare per separare i segnali fornisce un approccio per rimuovere questi segnali confondenti dai segnali donatore e accettore prima di calcolare le loro efficienze FRET. La libreria spettrale a sei componenti può quindi essere utilizzata per eseguire l'unmixing spettrale lineare per ogni fetta nell'immagine assiale. Qui, si possono osservare le variazioni dell'efficienza FRET e dei livelli di AMP ciclico in diverse fette del piano XY, consentendo un confronto tra le condizioni basali e le condizioni 10 minuti dopo il trattamento con forskolina .
Questa tecnica potrebbe anche essere utilizzata per quantificare l'efficienza FRET di altri reporter in tre dimensioni sia nelle cellule che nei tessuti.
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Panoramica
Questo studio affronta le sfide legate alla misurazione dei segnali di cAMP in tre dimensioni spaziali mediante sensori basati sul trasferimento di energia per risonanza di Fӧrster (FRET). Viene presentata una nuova metodologia di imaging FRET iperspettrale che consente la visualizzazione e la misurazione della distribuzione del cAMP all'interno di singole cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Segnalazione dell'AMP ciclico
- Tecnologia di imaging FRET
- Dinamica cellulare in tre dimensioni
Sfondo
- Rapporto segnale-rumore (SNR) basso nei sensori FRET tradizionali
- Importanza delle misurazioni tridimensionali dell'AMPc
- Applicazioni nei percorsi di segnalazione cellulare
Metodi Utilizzati
- Immagini iperspettrali per l'analisi FRET
- Microscopia confocale per l'acquisizione di immagini
- Tecniche di separazione spettrale lineare
Risultati principali
- Misurazione riuscita della distribuzione del cAMP in tre dimensioni
- Visualizzazione delle risposte cellulari al trattamento con forskolina
- Dimostrata utilità dello scorporo lineare per la separazione del segnale
Conclusioni
- Questa metodologia fornisce un quadro solido per lo studio della dinamica dell'AMPc ad alta risoluzione.
- Migliora la comprensione dei percorsi di segnalazione nella biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una mappatura spaziale accurata della dinamica dei messaggeri secondari è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nelle vie di segnalazione dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) e dell'adenilato ciclasi. Questo approccio FRET iperspettrale consente una risoluzione tridimensionale dei segnali di AMPc, riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla compartimentalizzazione subcellulare. Il metodo supporta una maggiore affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando i modelli spaziali di AMPc alle risposte cellulari funzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche risolvendo la compartimentalizzazione del cAMP in tre dimensioni spaziali.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale delle target mediante la visualizzazione di schemi di segnalazione specifici per via in cellule vive.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio correlando le distribuzioni spaziali del cAMP con esiti fenotipici a seguito di perturbazioni farmacologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture quantitative ed espazialmente risolte dell'efficienza FRET adatte a formati di screening ad alto contenuto.
- Riproducibilità: Utilizza la disambiguazione spettrale lineare per minimizzare l'autofluorescenza e il crosstalk spettrale, migliorando l'affidabilità del segnale tra replicati.
- Scalabilità: Compatibile con l'adattamento a piastre multipozzetto per lo screening degli effetti di composti sulle dinamiche subcellulari di cAMP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a cellule endoteliali microvascolari polmonari, supporta studi traslazionali sui percorsi di segnalazione vascolare.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se le variazioni osservate del cAMP siano dovute a una reale modulazione del percorso o ad artefatti di imaging causati da sovrapposizione spettrale.
- Continuità preclinica: Consente il monitoraggio longitudinale della dinamica del cAMP dalla scoperta alla validazione funzionale in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'ottimizzazione del composto attivo, fornendo letture quantitative con risoluzione spaziale dell'attività del secondo messaggero.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mappando la dinamica dell'AMPc in risposta ad agonisti del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) o modulatori dell'adenilato ciclasi.
- Screening: Fornisce dati tridimensionali sull'AMPc pronti per i saggi, riducendo i falsi positivi derivanti da interferenze spettrali.
- Analisi: Produce mappe dell'efficienza FRET e della concentrazione di AMPc che consentono il confronto tra diverse condizioni di trattamento e perturbazioni genetiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici grazie all'utilizzo in cellule endoteliali primarie e all'adattabilità a modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità centrale di imaging riutilizzabile per lo studio della segnalazione spaziale in diversi sistemi di messaggeri secondari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione del cAMP risolvendo le distribuzioni assiali e laterali.
- Valore operativo: Standardizza le misurazioni FRET mediante separazione basata su librerie spettrali e parametri di acquisizione riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) fornendo dati di interazione con il bersaglio contestualizzati dal punto di vista spaziale.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti in base alla fedeltà della segnalazione a livello subcellulare, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging iperspettrale, nell'analisi di separazione spettrale e nella validazione di biosensori FRET.
- È dipendente dalla microscopia confocale dotata di rilevatore spettrale e capacità di rilevazione a 32 canali.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la generazione delle librerie spettrali e dei parametri di separazione spettrale.
- L'adattamento ad altri tipi cellulari potrebbe richiedere un'ottimizzazione della densità di marcatura e dei parametri dello stack z.
- I limiti pratici includono il rischio di fotodegradazione durante l'acquisizione prolungata di stack z e il carico computazionale richiesto dall'elaborazione spettrale.
