Name: Un modello di topo di instabilità della colonna lombare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Scopri un modello murino di instabilità lombare per studiare la degenerazione del disco intervertebrale mediante resezione chirurgica. Questo metodo riproducibile utilizza topi C57BL/6 e analisi istomorfometrica 3D per valutare i cambiamenti strutturali.

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Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81973607) e essential drug research and development (2019ZX09201004-003-032) del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina.

Le indagini descritte sono conformi alle Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dei National Institutes of Health e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università cinese tradizionale di Shanghai. Tutte le manipolazioni chirurgiche sono state eseguite in anestesia profonda e gli animali non hanno avuto dolore in nessuna fase durante la procedura.
1. Preparazione pre-operazione
<ol><li>Sterilizzazione dello strumento: Sterilizzare a vapore gli strumenti chirurgici in autoclave (121 °C per 15 minuti) prima dell'intervento chirurgico. Imballare gli strumenti in un contenitore di metallo e mantenerli fino a quando non vengono utilizzati nell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Configurazione della piattaforma chirurgica: assegnare un'area del banco di almeno 60 cm x 60 cm per l'operazione. Pulire la superficie dell'area con il 75% di alcol e coprire con un asciugamano medico usa e getta. Posizionare un pacchetto di strumenti chirurgici sterili, reagenti, oggetti chirurgici su un asciugamano medico usa e getta all'interno dell'area superiore 1/3. Lasciare puliti i restanti 2/3 dell'area per l'operazione chirurgica. Aggiungere un hotpad sotto il pad chirurgico per il supporto termico.</li>
	<li>Preparazione animale<ol>
<li>Posizionare l'animale (topi C57BL/6J, maschio, 8 settimane) nella camera di induzione. Accendere il vaporizzatore ad un livello di induzione del 4% per l'isoflurane e di 4 L/min per l'ossigeno. Dopo che l'animale è stato completamente anestetizzato, mantenere l'anestetico con il cono del naso e la consegna anestetica ad un livello dell'1,5% per l'isoflurane e di 0,4 L / min per l'ossigeno durante l'intervento chirurgico. Monitorare l'animale per la respirazione.</li>
		<li>Applicare l'unguento per gli occhi cloretraciclina cloridrato per prevenire la secchezza corneale durante l'intervento chirurgico.</li>
		<li>Radere l'area chirurgica sulla superficie dorsale dalla regione toracica inferiore alla parte superiore della regione sacrale usando un piccolo trimmer animale. Rimuovere la pelliccia rasata con salviette tissutali.</li>
		<li>Applicare la crema depilatoria sulla zona rasata e lasciarla lì non più di 3 minuti. Rimuovere la crema con garza e lavare con 2 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%.</li>
		<li>Posizionare un cuscinetto cilindrico chirurgico su misura (Figura 2A) sotto l'addome del mouse per sollevare la colonna lombare e facilitare l'operazione chirurgica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Esposizione del terzo lombare al quinto lombare (L3–L5)processi spinosi
<ol><li>Utilizzare l'indice per toccare i processi spinosi sottocutanei delle vertebre lombari, che sono più esteriori, e confrontare con le vertebre toraciche e le vertebre sacrali per identificare la regione lombare.</li>
	<li>Risciacquare la pelle usando il 75% di alcol. Eseguire un'incisione cutanea della linea mediana di 3-4 cm sulla regione del legname dalla regione toracica media all'anca usando una lama bisturi per esporre la fascia.</li>
	<li>Identificare la colonna lombare per la morfologia della fascia posteriore inserita sulle punte dei processi spinosi. Nel dettaglio, la terza fascia lombare (L3)e la prima fascia sacrale (S1)sono distinte dalle altre fasce per le loro forme a "V". L'ultima punta a "V" si collega alla prima fascia sacrale (S1)e la prima punta "V" corrisponde al processo spinoso L3 (Figura 2B).</li>
	<li>Effettuare le incisioni muscolari paraspinose posteriori lungo i processi spinosi da L3 a L5 su entrambi i lati lateralmente con una lama bisturi (Figura 2C). Controllare la profondità di incisione verso le sfaccettature per ridurre l'emorragia.</li>
	<li>Separare gli strati muscolari utilizzando due forcep oftalmiche per esporre da L3 a L5 processi spinosi e legamenti sopraspinosi.</li>
</ol>3. Resezione dei processispinosiL 3 –L5 insieme ai legamenti
<ol><li>Separare i singoli processi spinosi tagliando i legamenti interspinosi utilizzando cesoie Venus (Figura 2D).</li>
	<li>Resect i processispinosiL 3 –L5 insieme ai legamenti interspinosi con cesoie Venus (Figura 2E).</li>
	<li>Suturare l'incisione cutanea con seta sterile intrecciata (sutura taglia 5.0) senza reattacco dei muscoli paravertebrali.</li>
	<li>Applicare l'unguento per gli occhi cloretraciclina cloridrato sul sito chirurgico.</li>
	<li>Somministrare Buprenorphine-SR (25 uL per grammo di peso del topo) immediatamente dopo l'intervento chirurgico LSI per l'analgesia.</li>
	<li>Posizionare gli animali in una camera calda e monitorare durante il recupero dall'anestesia. Monitorare l'assunzione di cibo e acqua prima di riportare gli animali nella gabbia di casa.</li>
	<li>Monitorare l'animale una volta al giorno per i primi 3 giorni dopo l'operazione. L'animale dovrebbe essere in grado di avere un appetito normale e dovrebbe guarire senza segni di pus, emorragia o gonfiore. Possono avere una lieve compromissione della locomozione.</li>
	<li>Eseguire operazioni fittizie solo dal distacco dei muscoli paravertebrali posteriori dalle vertebre L3–L5.</li>
</ol>

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<li>Nemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+changes+in+intervertebral+discs+after+smoking+and+cessation%3A+experimental+study+using+a+rat+passive+smoking+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Science%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Orthopaedic+Association%22%5BJournal%5D)">Histological changes in intervertebral discs after smoking and cessation: experimental study using a rat passive smoking model.</a> Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Mulholland, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myth+of+lumbar+instability%3A+the+importance+of+abnormal+loading+as+a+cause+of+low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">The myth of lumbar instability: the importance of abnormal loading as a cause of low back pain.</a> European Spine Journal. 17 (5), 619-625 (2008).</li>
<li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignaling+activation+of+TGF%CE%B2+maintains+intervertebral+disc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanosignaling activation of TGFβ maintains intervertebral disc homeostasis.</a> Bone Research. 5, 17008(2017).</li>
<li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+activation+of+tgf%CE%B2+by+spinal+instability+causes+vertebral+endplate+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Excessive activation of tgfβ by spinal instability causes vertebral endplate sclerosis.</a> Scientific Reports. 6, 27093(2016).</li>
<li>Ni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+innervation+in+porous+endplates+by+Netrin-1+from+osteoclasts+mediates+PGE2-induced+spinal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sensory innervation in porous endplates by Netrin-1 from osteoclasts mediates PGE2-induced spinal hypersensitivity in mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 5643(2019).</li>
<li>Liu, S., Cheng, Y., Tan, Y., Dong, J., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligustrazine+prevents+intervertebral+disc+degeneration+via+suppression+of+aberrant+tgf%CE%B2+activation+in+nucleus+pulposus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Ligustrazine prevents intervertebral disc degeneration via suppression of aberrant tgfβ activation in nucleus pulposus cells.</a> BioMed Research International. 2019, 5601734(2019).</li>
<li>Boos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+age-related+changes+in+lumbar+intervertebral+discs%3A+2002+Volvo+Award+in+basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science.</a> Spine. 27 (23), 2631-2644 (2002).</li>
<li>Miyamoto, S., Yonenobu, K., Ono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cervical+spondylosis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Experimental cervical spondylosis in the mouse.</a> Spine. 16, 10 Suppl 495-500 (1991).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo sviluppato il modello di topo di instabilità della colonna lombare basato sul modello cervicale del topo di spondilosi in cui i muscoli paravertebrali posteriori delle vertebre sono stati staccati e i processi spinosi insieme ai legamenti sopraspinosi e interspinosi sono stati resected25. Abbiamo eseguito un'operazione simile sulla colonna lombare, che ha processi spinosi più prominenti. Il modello di mouse LSI sviluppò un IDD simile nella colonna lombare.
I van...

La degenerazione intervertebrale del disco (IDD) è comunemente osservata nell'invecchiamento e persino nei giovani causati da molti fattori1. L'intervento chirurgico per i pazienti che soffrono di IDD, causando lo mal di schiena e movimenti compromessi, viene solitamente eseguito in una fase successiva o in casi gravi e ha potenziali rischi come non unione o infezione2. Il trattamento non operativo ideale richiede una comprensione completa del meccanismo IDD. Il modello animale IDD funge da strumento cruciale per gli studi sul meccanismo IDD e la valutazione del trattamento IDD.
Animali più grandi sono stati scelti per modelli IDD come primati, pecore, capre, cani e conigli a causa della loro somiglianza con la struttura anatomica umana in larga misura e della forte operabilità in termini di dimensioni dei dischi intervertebrali (IVD)3,4,5,6,7,8. Tuttavia, questi modelli animali richiedono molto tempo e costi aggiuntivi9. Mouse IVD è una scarsa rappresentazione dell'IVD umano basata su misurazioni geometriche delle proporzioni, del rapporto nucleo pulposo/area del disco e dell'altezzanormalizzata 10. Nonostante la differenza di dimensioni, il segmento IVD lombare del mouse presenta proprietà meccaniche simili all'IVD umano come la compressione e la rigidità della torsione11. Inoltre, il modello IDD del topo ha il vantaggio di uno sviluppo IDD a basso costo e relativamente breve e più opzioni per animali e anticorpi geneticamente modificati utilizzati in ulteriori studimeccanicistici 12,13,14,15.
I modelli IDD indotti dalla sperimentalità variano dagli induttori e dalle applicazioni. Ad esempio, la degenerazione della matrice extracellulare indotta dalla collagenasi (ECM) è appropriata per la ricerca sulla rigenerazione dell'ECM16. Il fenotipo geneticamente modificato è adatto per lo studio della funzione genica nel processo IDD e nelle terapie genetiche17. I modelli di incisione fibrosa e fumo delle annulus imitano il trauma e l'IDD12,18 .
L'instabilità spinale (SI) porta a una colonna vertebrale instabile che non si trova in uno stato ottimale di equilibrio. Può essere causato da movimenti anomali di un segmento di movimento lombare a causa della debolezza del tessuto di supporto circostante come legamenti e muscoli. È anche comunemente visto operazione post fusione spinale19. SI è considerata la causa principale dell'IDD. Pertanto, miriamo a sviluppare un modello di topi SI (focalizzato sulla colonna lombare) che imita il processo di IDDumano 20,21.
Nel protocollo, abbiamo introdotto la procedura per stabilire il modello di topo di instabilità spinale lombare (LSI) mediante la resezione del terzo lombare (L3)al quinto lombare (L5)processi spinosi insieme ai legamenti sopraspinosi e interspinosi(figura 1A,B). Il modello animale sviluppa L'IDD già 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, come dimostrato da ipertrofia e porosità nelle piastre finali (EP). Il volume dell'IVD inizia a diminuire 2 settimane dopo l'intervento chirurgico attraverso 16 settimane insieme all'aumento del punteggio IVD, che indica il grado di IDD. Riteniamo che la procedura dettagliata e visiva sia utile per i ricercatori per stabilire il modello di mouse LSI nel loro laboratorio e applicare alla ricerca IDD se necessario.

<table><tbody><tr><td>Clortetraciclina cloridrato unguento per gli occhi</td><td>Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H31021931</td><td>Prevenire la secchezza oculare, Prevenire l'infezione della ferita</td></tr><tr><td>C57BL / 6J topi maschi</td><td>Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN)</td> <td>SCXK2018-0004</td><td>Modello animale</td></tr><tr><td>Asciugamano medico usa e getta</td><td>Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd.</td><td>20160090</td><td>Piattaforma per l'operazione chirurgica</td></tr><tr><td>Apparecchiature per anestesia inalante</td><td>MIDMARK</td><td>Matrx 3000</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd.</td><td>1903715</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Lidocaina cloridrato</td><td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022839</td> Ago da sutura medico <td>antidolorifico</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>20S0401J</td><td>Sutura pelle</td></tr><tr><td>Pinze oftalmiche</td><td>Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabbrica di strumenti chirurgici</td><td>JD1050</td><td>Clip la pelle</td></tr><tr><td>Forbici oftalmiche (10 cm)</td><td>Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabbrica di strumenti chirurgici</td><td>Y00030</td><td>Incisione cutanea</td></tr><tr><td>seta intrecciata</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>11V0820</td><td>Sutura pelle</td></tr><tr><td>Piccolo animale trimmer</td><td>Shanghai Feike Electric Co., Ltd.</td><td>FC5910</td> Lame chirurgiche sterili per <td>la depilazione</td></tr><tr><td>(12 #)</td> <td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.</td><td>35T0707</td><td>Incisione muscolare</td></tr><tr><td>Veet crema di depilazione</td><td>RECKITT BENCKISER (India) Ltd</td><td>NA</td><td>Depilazione</td></tr><tr><td>Venus cesoie</td><td>Mingren attrezzature mediche Lunghezza</td><td>: 12,5 cm</td><td>Clip il muscolo e il processo spinoso</td></tr></tbody></table>

un modello di topo di instabilità della colonna lombare

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

La degenerazione del disco intervertebrale (IDD) è un cambiamento patologico comune che porta alla lombracato. Si desidera modelli animali appropriati per comprendere i processi patologici e valutare nuovi farmaci. Qui, abbiamo introdotto un modello di topo di instabilità della colonna lombare (LSI) indotto chirurgicamente che sviluppa IDD a partire da 1 settimana dopo l'operazione. Nel dettaglio, il topo in anestesia è stato azionato da incisione della pelle posteriore bassa, esposizione ai processi spinosi L3-L5, distacco dei muscoli paraspinosi, resezione dei processi e dei legamenti e chiusura della pelle. Perl'osservazionesonostati scelti 4 -L 5 IVD. Il modello LSI sviluppa l'IDD lombare per porosità e ipertrofia nelle piastre finali in una fase precoce, diminuzione del volume del disco intervertebrale, restringimento del pulposo del nucleo in uno stadio intermedio e perdita ossea nelle vertebre lombari (L5)in una fase successiva. Il modello di mouse LSI ha i vantaggi di una forte operabilità, nessun requisito di attrezzature speciali, riproducibilità, poco costoso e un periodo relativamente breve di sviluppo IDD. Tuttavia, l'operazione LSI è ancora un trauma che causa infiammazione entro la prima settimana dopo l'operazione. Pertanto, questo modello animale è adatto per lo studio dell'IDD lombare.

Il modello di topo LSI viene applicato negli studi del meccanismo IDD, del trattamento IDD, della degenerazione della piastra finale (EP) come la sclerosi e dell'innervazione sensoriale nell'EP20,21,22,23. Il mouse LSI sviluppa cambiamenti degenerativi IDD ed EP, come identificato, da una diminuzione del volume e dell'altezza dell'IVD, da un aumento del volume ep e da un aumento dei punteggi IV...

Abbiamo sviluppato un modello di topo di degenerazione del disco intervertebrale lombare per resezione dei processispinosiL 3 –L5 insieme a legamenti sovra- e inter-spinosi e distacco di muscoli paraspinosi.

Un modello di topo di instabilità della colonna lombare

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Questo è un intervento chirurgico per indurre il modello del topo offre un'alternativa per gli studi relativi alla degenerazione del disco intervertebrale lombare. Questa robusta modalità LSI non richiede attrezzature speciali. È riproducibile e può essere usato per indurre la degenerazione del disco intervertebrale in un periodo di tempo relativamente breve.Controllare le profondità di incisione e l'emorragia ed eseguire per la resezione di ogni processo interspinoso sono due spese chiave per l'impianto del nostro successo per l'esperimento. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, posizionare un topo a sei settimane anestetizzato di otto settimane, maschio, C57 nero su un cuscinetto chirurgico in posizione supina e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Utilizzare un piccolo trimmer animale per radere l'area chirurgica dalla regione toracica inferiore alla parte superiore della regione sacrale e rimuovere la pelliccia rasata con salviette tissutali.Applicare la crema depilatoria sulla zona rasata usando la garza per rimuovere la crema dopo non più di tre minuti e lavare la pelle esposta con due millilitri di 0,9 soluzione salina sterile. Quindi posizionare un cuscinetto cilindrico chirurgico su misura sotto l'addome per sollevare la colonna lombare. Per esporre le vertebre L3 e L5 utilizzare l'indice per toccare i processi spinosi sottocutanei delle vertebre lombari e palpati per confrontare i processi con quelli delle vertebre toraciche e delle vertebre sacrali per identificare la regione lombare.Risciacquare la pelle con il 75% di alcol e utilizzare un microscopio sezionante utilizzare un bisturi per fare un'incisione della pelle mediolinea da tre a quattro centimetri sulla regione lombare dalla regione toracica media all'anca. Identificare la colonna lombare dalla forma a V della fascia posteriore inserita, nella punta in modo che i processi spinosi e utilizzare il bisturi per effettuare incisioni muscolari paraspinose posteriori poco profonde lungo i processi spinosi da L3 a L5 lateralmente su entrambi i lati della colonna vertebrale. Quindi utilizzare due paia di forcep oftalmiche per separare gli strati muscolari per esporre l'L3 a processi spinosi L5 e legamenti sopraspinosi.Per separare i singoli processi spinosi utilizzare sheers venosi per tagliare i legamenti interspinosi e per resect i processi spinosi da L3 a L5 e legamenti interspinosi. Quindi utilizzare suture intrecciate di seta numero cinque sterili per chiudere l'incisione cutanea senza ricollegare i muscoli paravertebrali e applicare l'unguento cloridrato di clorotraciclina al sito chirurgico. L'analisi istomorfometrica 3D consente la misurazione del disco intervertebrale, mentre l'analisi strutturale 3D consente la quantificazione del volume totale dei tessuti.Il volume del disco intervertebrale aumenta significativamente una settimana dopo l'intervento chirurgico prima di diminuire da due a 16 settimane dopo la procedura coerente con una diminuzione dell'altezza del disco intervertebrale misurata nello stesso periodo di tempo. L'aumento delle cavità all'interno delle piastre cranici si osserva anche nei topi LSI quantificato da una maggiore percentuale di valori di separazione trabecolare maggiore o uguale a 0,089 e da un aumento significativo dei volumi della piastra finale dopo la chirurgia. Le piastre finali del modello mostrano un fenotipo simile, che indica che l'LSI porta all'ipertrofia della piastra finale e ad un aumento del numero di cavità.I volumi di vertebre L5 aumentano leggermente dopo l'intervento chirurgico con differenze statistiche osservate a 16 settimane. Una significativa diminuzione del rapporto tra volume osseo e tessuto totale è presente anche 16 settimane dopo l'intervento chirurgico, indicando che l'LSI causa la perdita ossea vertebrale in una fase successiva. Una riduzione dei vacuoli intracellulari delle cellule pulpose del nucleo è accelerata anche negli animali LSI con un aumento del numero di osteoclasti osservato nelle piastre finali LSI.Questo modello può essere modificato attaccando un numero diverso di vertebre, come la quinta solo lombare, o dal primo lombare al quinto lombare.

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