Name: Preparazione dellinoculo arricchito da virus per linfezione orale delle api mellifere (Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Scopri come produrre particelle virali da pupae di Apis mellifera per bioassay ad alto rendimento. Questo metodo semplifica lo studio delle infezioni virali negli impollinatori.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare la dott.ssa Julia Fine per le sue idee e discussioni durante il processo di creazione del protocollo, così come la dott.ssa Cassondra Vernier per i suoi utili commenti durante l'editing. Questi materiali hanno contribuito a progetti che sono stati sostenuti in parte dalla Foundation for Food and Agriculture Research, nell'ambito della sovvenzione ID 549025.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo delineato metodi che descrivono in dettaglio ogni fase del processo di amplificazione del virus e di preparazione dello stock di inoculo, compresa la raccolta delle larve e la propagazione, l'estrazione e la concentrazione del virus, nonché il trattamento virale sotto forma di esperimenti di alimentazione in gabbia. Questi metodi consentono la produzione di particelle virali semi-pure (Figura 4), la cui efficacia può essere costantemente quantificata mediante test di mortalità do...

Le api mellifere (Apis mellifera) svolgono un ruolo fondamentale nel moderno paesaggio agricolo globale, ma attualmente soffrono di una combinazione di fattori di stress biotici e abiotici, tra cui esposizione a pesticidi, foraggio scadente, parassiti e agenti patogeni 1,2. Uno dei più importanti agenti patogeni di preoccupazione sono i virus, molti dei quali sono vettorizzati da un altro dei principali fattori di stress delle api da miele, l'acaro parassita Varroa (Varroa destructor). Questi virus possono causare una serie di effetti negativi nelle api mellifere tra cui una ridotta sopravvivenza della covata, difetti dello sviluppo e paralisi che possono portare al collasso totale dell'alveare sia prima che dopo i periodi di svernamento 3,4,5. Sebbene ci siano stati progressi promettenti nello sviluppo di tecnologie utilizzate per combattere l'infezione da virus 6,7,8,9, le dinamiche con cui molti virus si propagano, si diffondono e interagiscono all'interno di un'ape o colonia di miele sono ancora poco conosciute 5,10 . Comprendere la biologia di base delle interazioni tra api e virus e le loro relazioni con altri fattori ambientali è fondamentale per lo sviluppo di tecniche efficaci di gestione dei virus.
Tuttavia, lo studio delle interazioni tra api e virus del miele pone sfide con numerosi fattori noti e sconosciuti che complicano il processo. Questi includono interazioni con la dieta11,12, esposizione ai pesticidi13 e background genetico delle api14,15. Anche quando ci si concentra solo sull'infezione da virus, le complicazioni sono comuni perché le popolazioni di api da miele, sia gestite che selvatiche, hanno sempre un certo grado di infezione da virus di fondo, anche se spesso senza manifestare sintomiacuti 16,17, e gli effetti della coinfezione da virus non sono ben compresi18. Ciò ha reso difficile districare lo studio degli effetti del virus delle api da miele.
Molti studi sul virus delle api da miele hanno utilizzato infezioni virali circostanziali per cercare interazioni con altri fattori di stress, osservando come le infezioni di fondo cambiano con altri trattamenti 12,19,20,21. Mentre questo approccio ha avuto successo nell'identificare effetti importanti, in particolare scoprendo come i pesticidi o i trattamenti dietetici influenzano i livelli e la replicazione del virus, l'inoculazione con un trattamento del virus di contenuto e concentrazione noti è fondamentale per i test sperimentali delle dinamiche di infezione da virus. Anche così, separare il trattamento sperimentale dall'infezione di fondo può anche porre delle sfide. Negli studi sul campo, i ricercatori hanno differenziato i ceppi del virus dell'ala deformata (DWV) per fornire prove della trasmissione del virus dalle api mellifere ai bombi22, ma l'uso di questo approccio sarebbe difficile solo all'interno delle api da miele. I cloni infettivi da virus sono uno strumento potente, non solo per il monitoraggio dell'infezione 23,24,25, ma per studi di genetica inversa sui virus delle api da miele e per la ricerca sull'interazione virus-ospite 26,27,28. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i cloni infettivi sono ancora necessari per soddisfare il ciclo di infezione all'interno delle cellule per produrre particelle. Tali particelle sono preferite come inoculi per trattamenti sperimentali perché la loro infettività è superiore all'RNA virale nudo e l'inoculazione con genomi incapsulati imita un'infezione naturale.
Anche la produzione di inoculi puri e incontaminati del virus delle api del miele (ceppi virali selvatici o derivati da cloni infettivi) pone delle sfide. Questi sono principalmente dovuti alle difficoltà nell'ottenere una linea cellulare di api da miele affidabile, a replicazione continua e priva di virus per produrre virus di ceppo puro29,30. Mentre alcune linee cellulari sono state prodotte, questi sistemi rimangono imperfetti; tuttavia, c'è la speranza che una linea cellulare praticabile possa essere prodotta29, il che consentirebbe un controllo più preciso della produzione e dell'indagine del virus. Fino a quando tale linea non sarà ampiamente disponibile, la maggior parte dei protocolli di produzione di virus continuerà a fare affidamento sull'uso della produzione e purificazione di virus in vivo 18,31,32,33,34. Questi approcci comportano l'identificazione e la purificazione di particelle virali di interesse (o la produzione di un clone infettivo) e il loro utilizzo per infettare le api da miele, di solito come pupe. Le pupe vengono iniettate con il virus bersaglio e poi sacrificate, e ulteriori particelle vengono estratte e purificate. Tuttavia, poiché nessuna ape è priva di virus per cominciare, c'è sempre un certo grado di contaminazione da tracce di altri virus in qualsiasi concentrato di questo tipo e, pertanto, è necessario prestare molta attenzione nella scelta delle api con una bassa probabilità di infezioni di fondo. Inoltre, i metodi per rimuovere le pupe dalle cellule del pettine per l'uso in questi protocolli33 sono molto laboriosi e possono indurre stress nelle api, limitando la produzione con questi mezzi18,32. Qui, riportiamo un metodo alternativo che consente la rimozione su larga scala delle larve con poco lavoro e meno stress meccanico sulle api.
Una volta ottenute le pupe e iniettate con l'inoculo del virus di partenza, devono essere incubate per fornire al virus il tempo di replicarsi. Successivamente, le particelle virali prodotte possono essere trasformate in una forma utilizzabile per infettare le api sperimentali. Esistono diversi metodi semplici per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'utilizzo di un omogeneizzato grezzo35,36 o emolinfa generata da api infette viralmente come fonte di infezione37. Questi metodi sono efficaci ma incontrano una maggiore possibilità di introdurre variabili sconosciute dal substrato di fondo (ad esempio, altri fattori negli omogeneizzati delle api morte). Inoltre, è auspicabile concentrare le particelle se un esperimento richiede di somministrare una dose ampia e nota di un virus in un breve periodo di tempo. Pertanto, per un migliore controllo, è preferibile utilizzare metodi che consentano un certo livello di purificazione e concentrazione delle particelle virali. Generalmente, una serie di fasi di precipitazione e centrifugazione comporterà la rimozione di quasi tutto il possibile materiale virale non bersaglio33.
Dopo aver prodotto questo inoculo concentrato, è utile quantificare i titoli virali (qPCR) e caratterizzarlo con biosaggi in vivo per testarne la vitalità e la capacità di causare mortalità, nonché per confermare che si ottengono titoli virali aumentati dopo l'infezione. Ciò può essere ottenuto attraverso esperimenti di iniezione (sia in pupe che in adulti) o esperimenti di alimentazione (in larve o adulti). Mentre tutti questi approcci sono possibili, l'alimentazione di gruppi di api adulte in una gabbia è spesso la più veloce e semplice. Il metodo di analisi della gabbia è anche ampiamente utilizzato per testare vari altri trattamenti sulle api, tra cui la tossicità dei pesticidi38, lo sviluppo dell'ovaio39 e l'influenza nutrizionale sul comportamento40,41 e, quindi, può costituire una buona base per esperimenti che collegano l'infezione da virus con altri fattori42.
Qui descriviamo un metodo affidabile per produrre grandi quantità di particelle virali semi-pure e altamente arricchite senza utilizzare un costoso ultracentrifuga, incluso un metodo per rimuovere le pupe che riduce il lavoro e lo stress meccanico sulle api e un biotest altamente ripetibile e ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Controllando strettamente la purezza dell'inoculo virale, i ricercatori sono in grado di ridurre la variazione della risposta virale delle api da miele rispetto ad altri metodi di inoculazione virale. Inoltre, il biotest può schermare gli effetti virali a livello di piccoli gruppi utilizzando unità sperimentali altamente ripetibili prima di scalare su impostazioni realistiche sul campo, che è molto più laborioso da gestire. In combinazione, questi due metodi forniscono gli strumenti necessari per gli studi che possono aiutare a migliorare la nostra comprensione generale delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

<table><tbody><tr>Soluzione <td></td><td></td><td></td><td>di candeggina al 10%</td></tr><tr><td>Cloroformio:alcool isoamilico</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>di etanolo</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr><tr><td>Gabbie per biotest</td><td></td><td></td><td>A seconda della configurazione sperimentale</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0,1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Opzionale (se non è disponibile alcun apparecchio iniettore)</td></tr><tr><td>Contenitori per l'autorimozione</td><td></td><td></td> larvale <td>Dovrebbe misurare circa 19" x 9-1/8" (dimensioni del telaio profondo Langstroth)</td></tr> <tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td>smussate e morbide per la separazione larvale; pinze smussate e dure per l'escissione delle pupe</td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td><td></td>aspirante</tr><tr><td>Incubatrice</td><td></td><td></td><td>In grado di mantenere 34 &ordm; C e 50% di umidità relativa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Qualsiasi salvietta assorbente funzionerà</td></tr><tr><td>Barche</td><td></td><td></td> di peso medio <td>Fungono da vassoi per inoculo</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa con membrana Biomax</td> Guanti in nitrile <td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> soluzione salina tamponata PBSSimmaAldrich</td><td></td> <td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> refrigerata da banco <td>capace di 15.000 x g</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> refrigerata <td>capace di 21.000 x g</td></tr><tr><td>Ripetitore M4 Multipipetta</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Opzionale (se non è presente alcun iniettore ThermoFisher</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza RNAsi</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (apis mellifera)

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Le api da miele sono di grande importanza ecologica e agricola in tutto il mondo, ma sono anche soggette a una varietà di pressioni che influenzano negativamente la salute delle api, compresa l'esposizione a patogeni virali. Tali virus possono causare un'ampia varietà di effetti devastanti e spesso possono essere difficili da studiare a causa di molteplici fattori che rendono difficile separare gli effetti dei trattamenti sperimentali dall'infezione di fondo preesistente. Qui presentiamo un metodo per produrre in serie grandi quantità di particelle virali insieme a un biotest ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Rese necessarie dall'attuale mancanza di una linea continua di cellule di api da miele prive di virus, le particelle virali vengono amplificate in vivo utilizzando pupe di api da miele, che vengono estratte dall'alveare in grandi volumi utilizzando una metodologia minimamente stressante. Queste particelle virali possono quindi essere utilizzate nei biotest delle gabbie delle api per testare la vitalità degli inoculi, nonché in varie altre dinamiche di infezione virale, comprese le interazioni con nutrizione, pesticidi e altri agenti patogeni. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di tali particelle è che riduce notevolmente le possibilità di introdurre variabili sconosciute nella sperimentazione successiva rispetto alle alternative attuali, come l'infezione tramite emolinfa delle api infette o omogeneizzato, anche se è necessario prestare attenzione quando si acquistano le api, per ridurre al minimo la contaminazione da virus di fondo. I saggi in gabbia non sostituiscono esperimenti su larga scala e realistici sul campo che testano gli effetti dell'infezione virale a livello di colonia, ma funzionano invece come metodo per stabilire risposte virali di base che, in combinazione con le particelle virali semi-pure, possono servire come strumenti importanti per esaminare varie dimensioni delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

Seguire con successo i protocolli (Figure 1) per l'iniezione pupale e l'estrazione virale dovrebbe produrre grandi quantità di particelle virali. Tuttavia, il campionamento e l'iniezione di pupe provenienti da una varietà di colonie in più punti temporali massimizza le possibilità di acquisire virus bersaglio con bassa contaminazione. La dinamica con cui i virus si replicano e interagiscono tra loro all'interno di un'ape mellifera non è ben compresa; accoppiato con la probabilità di infezione preesistent...

Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Il nostro protocollo dimostra come produrre in massa particelle virali di api mellifere per il loro utilizzo in biosaggi controllati e ad alto rendimento per uno screening rapido dell'efficacia del trattamento virale. Il test utilizza pupe di api facili da coltivare piuttosto che colture cellulari, riducendo il lavoro necessario per ottenere soggetti sperimentali. Il virus può quindi essere utilizzato per produrre curve di mortalità prevedibili e biotest ripetibili.C'è stato un notevole interesse nel capire come i cosiddetti virus delle api mellifere influenzino una gamma di ospiti più ampia. Questa tecnica di produzione del virus può essere abbinata ad altri sistemi di impollinatori per testare l'infettività. Per l'estrazione di massa delle api mediante autorimozione larvale, metti in gabbia una regina delle api mellifere su un telaio Langstroth vuoto e allungato e riportala alla sua colonia.Dopo aver lasciato che la regina deponesse le uova sul telaio per 24 ore, controlla il telaio per assicurarti che la maggior parte delle celle del favo contenga uova appena deposte e rilascia la regina. Esattamente 192 ore dopo aver ingabbiato la regina, rimuovere il telaio dalla colonia e spa

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l'applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

Qui si descrive il nostro protocollo dettagliato per la preparazione di colonie di api singola coorte - uno strumento utile per analizzare la fisiologia dei lavoratori di ruolo associati. Descriviamo anche protocolli dettagliati per il trattamento di lavoratori con ormone giovanile e ecdysone per valutare il coinvolgimento di questi ormoni nella regolazione del comportamento dei lavoratori e / o la fisiologia.

Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

Consorzi microbici all'interno alveari dell'ape di bumble arricchiscono e preservare il polline per larve di ape. Mediante sequenziamento di nuova generazione, insieme al laboratorio ed esperimenti sul campo, questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per verificare l'ipotesi che residui di fungicidi alterano il microbioma di polline e demographics di Colonia, infine conducendo alla Colonia perdita.

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.

Manipolazione neurofarmacologico di sobrio e-volo libero api mellifere,<em&gt; Apis mellifera</em

Qui vi presentiamo   un metodo per alimentare antiparassitario alimenti contaminati sia un individuo ape e una colonia alveare. La procedura valuta l'effetto dei pesticidi sulle singole api mellifere in vivo l'alimentazione della dieta larvale di base e anche la condizione naturale della colonia dell'alveare.

Valutare l&#39;effetto delle sostanze chimiche ambientali su Honey Bee sviluppo dall&#39;individuo alla colonia Livello

Le dosi subletali di pesticidi possono influire sulle colonie in modi che sono difficili da rilevare utilizzando solo metodi periodici o visual. Metodi per misurare la massa totale dell'ape adulta, nidiata e le risorse alimentari di pesatura alveari e parti di alveare, fotografare fotogrammi e l'installazione di sensori, sono fornite. Analisi dei dati si rivolge anche.

Monitoraggio effetti Colonia-livello di esposizione dell'antiparassitario subletali sulle API di miele

Spray di fungicida per le piante di fioritura può esporre API solitarie ad alte concentrazioni di residui a carico di polline fungicida. Utilizzando esperimenti di laboratorio che coinvolgono in vitro-larve di ape allevati, questo studio indaga gli effetti interattivi di consumo fungicida-trattati polline derivato da piante ospite e non host.

In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale

Questo protocollo è stato sviluppato per migliorare la comprensione di come le sostanze agrochimiche influenzano la riproduzione delle apimellifere ( Apis mellifera) stabilendo metodi per esporre le regine delle api da miele e i loro custodi operai ai prodotti agrochimici in un ambiente controllato e di laboratorio e monitorando attentamente le loro risposte pertinenti.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Questa metodologia, che includeva l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica, potrebbe valutare efficacemente l'influenza delle barriere dell'intestino medio e / o delle ghiandole salivari sull'infezione da arbovirus.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Scopri come produrre particelle virali da pupae di Apis mellifera per bioassay ad alto rendimento. Questo metodo semplifica lo studio delle infezioni virali negli impollinatori.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Esplora altri video