Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Il nostro protocollo dimostra come produrre in massa particelle virali di api mellifere per il loro utilizzo in biosaggi controllati e ad alto rendimento per uno screening rapido dell'efficacia del trattamento virale. Il test utilizza pupe di api facili da coltivare piuttosto che colture cellulari, riducendo il lavoro necessario per ottenere soggetti sperimentali. Il virus può quindi essere utilizzato per produrre curve di mortalità prevedibili e biotest ripetibili.

C'è stato un notevole interesse nel capire come i cosiddetti virus delle api mellifere influenzino una gamma di ospiti più ampia. Questa tecnica di produzione del virus può essere abbinata ad altri sistemi di impollinatori per testare l'infettività. Per l'estrazione di massa delle api mediante autorimozione larvale, metti in gabbia una regina delle api mellifere su un telaio Langstroth vuoto e allungato e riportala alla sua colonia.

Dopo aver lasciato che la regina deponesse le uova sul telaio per 24 ore, controlla il telaio per assicurarti che la maggior parte delle celle del favo contenga uova appena deposte e rilascia la regina. Esattamente 192 ore dopo aver ingabbiato la regina, rimuovere il telaio dalla colonia e spazzolare via eventuali api adulte. Al ritorno in laboratorio, posizionare il telaio in un'incubatrice impostata sulle condizioni interne di un alveare e pulire accuratamente i contenitori della stessa altezza e larghezza del telaio riempito di larve con acqua e sapone sequenziali, candeggina e lavaggi con etanolo.

Foderare il fondo dei contenitori con diversi strati di carta assorbente e aggiungere diversi strati sovrapposti di materiale assorbente più sottile. Quando i contenitori sono pronti, posiziona il telaio sul lato focale delle larve del contenitore rivolto verso il basso e usa un pezzo di foglio di alluminio a tenda per coprire il contenitore e il telaio. Dopo l'incubazione notturna, sollevare con cautela le singole salviette dallo strato superiore di ciascun contenitore per consentire alle larve di essere versate delicatamente su un vassoio di trasferimento.

Quindi, usa una pinza smussata e morbida per distribuire le larve sulla superficie dei vassoi senza toccarli e posiziona il vassoio coperto con un foglio di alluminio nell'incubatrice fino a quando le larve non si impupano e maturano fino allo stadio di occhio largo. Per l'iniezione virale delle pupe, mescolare le particelle virali di interesse alla concentrazione appropriata in PBS sterile in una provetta da 15 millilitri e collegare un apparecchio iniettore a una multipipetta manuale. Per testare l'efficacia dell'iniettore, caricare l'iniettore con 100 microlitri di acqua ed erogare l'acqua in dosi da un microlitro.

Se le iniezioni sono accurate, caricare 100 microlitri della soluzione di particelle virali nell'iniettore e afferrare delicatamente una pupa lungo il torace, applicando una pressione sufficiente a forzare i fluidi interni nell'addome per rendere più evidenti le divisioni del tergite. Stabilizzando il braccio che tiene la siringa contro il banco da laboratorio per il supporto, inserire l'ago appena nella cuticola tra il terzo e il quarto tergite addominale e iniettare un microlitro di soluzione virale. Quando tutte le pupe sono state iniettate, coprire nuovamente il vassoio con un foglio di alluminio prima di rimettere le pupe nell'incubatrice per altri tre-cinque giorni.

Al termine dell'incubazione, raggruppare le pupe per fonte di colonia in singole provette da centrifuga coniche da 50 millilitri e vorticare per omogeneizzare il contenuto. Per eseguire un biotest di alimentazione virale, tappare i fori di alimentazione delle gabbie pulite con una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate e riempire parzialmente le provette da centrifuga da 15 millilitri con una soluzione di alimentazione appena preparata. Quindi, capovolgi i tubi e usa una puntina da disegno per praticare uno o due fori attorno alle punte.

Quindi, spazzola tutte le api appena emerse dalle loro scatole di emergenza in un recipiente di raccolta leggermente rivestito intorno ai bordi con olio vegetale e mescola delicatamente le api a mano. Trasferisci 35 singole api in un'unica tazza unta e metti il contenuto della tazza in una gabbia acrilica. Per preparare l'inoculo virale, mescolare una quantità appropriata di particelle virali concentrate e scongelate con una soluzione di saccarosio al 30% in un contenitore sterile per tipo di trattamento e aggiungere 600 microlitri di soluzione virale su vassoi di inoculo individuali.

Quindi, inserire con cura ogni vassoio di inoculo nelle gabbie corrispondenti, facendo attenzione a non rilasciare accidentalmente le api. Quando tutti gli inoculi sono stati consumati, sostituire i tubi da centrifuga dal foro di alimentazione superiore con i tubi di alimentazione preparati e registrare la mortalità all'interno di ciascuna gabbia a intervalli di 12 ore per le prime 72 ore dell'esperimento e successivamente ogni 24 ore. Per rimuovere le api morte, fai scorrere la porta della gabbia verso l'alto quel tanto che basta per consentire l'inserimento di un paio di pinze sterilizzate con alcol per estrarre le api morte.

A seconda del design dell'esperimento, posizionare i campioni vivi di ciascuna gabbia in singole provette da centrifuga su ghiaccio secco per consentire il campionamento per le misurazioni del titolo virale. In questo sforzo rappresentativo di raccolta di virus più ampio, ogni pupa è stata inizialmente iniettata con un inoculo di virus della paralisi acuta israeliano per circa il 95%. Sebbene 10 dei 16 campioni di colonie coinvolti in queste estrazioni contenessero virus altamente puri, altri campioni variavano nella loro proporzione virale, con alcuni addirittura dominati da altri virus, come il virus dell'ala deformata.

Come illustrato nella tabella, i valori del ciclo di soglia possono essere utilizzati come predittore della proporzione. Il confronto delle curve dose-risposta delle api mellifere alimentate con le stesse particelle virali per due anni diversi rivela che, nonostante gli identici parametri dei test, gli studi condotti nel 2018 e nel 2019 hanno prodotto risposte di sopravvivenza notevolmente diverse in tutti i gruppi di trattamento tranne quelli di controllo, che non hanno ricevuto virus nel loro inoculo di saccarosio. Le risposte delle api all'infezione virale possono variare notevolmente a seconda della stagione, dell'alveare o persino della distribuzione dell'inoculo all'interno delle singole gabbie.

Pertanto, campioni di grandi dimensioni sono fondamentali per confermare gli effetti del trattamento. Utilizzando scorte di particelle virali, l'esperimento può essere ampliato per includere iniezioni di api operaie adulte, regine o fuchi, o ad altre specie di impollinatori per valutare la gamma di ospiti. Le scorte infettive di virus possono essere utilizzate per testare il modo in cui l'infezione interagisce con altri fattori, come la dieta, l'esposizione chimica o gli ambienti sociali.