Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

Il metodo consente studi su scala nanometrica dei batteri. Ci fornisce una visione dettagliata delle alterazioni chimiche della resistenza agli antimicrobici. Pertanto, può contribuire alla nostra comprensione della resistenza antimicrobica e dello sviluppo di farmaci.

Le dimensioni su scala nanometrica dei batteri limitano significativamente gli strumenti di ricerca disponibili in grado di sondare la loro chimica. L'AFM-IR ci permette di farlo in modo non distruttivo e indipendente dall'osservatore, anche a livello subcellulare. Fornendo una visione della resistenza antimicrobica, il metodo può aiutare a identificare e testare bersagli molecolari per nuovi antimicrobici.

Oltre ai batteri, l'AFM-IR può sondare una serie di cellule, tessuti e persino virus. Per preparare un campione per l'imaging AFM-IR, dopo aver coltivato i batteri di interesse sul terreno appropriato nelle condizioni di coltura appropriate, utilizzare un anello sterile per prelevare accuratamente i batteri dalla parte superiore delle colonie per il trasferimento in un tubo di vetro. Aggiungere un millilitro di acqua ultrapura al tubo e agitare per uno o due minuti fino a quando il pellet batterico raccolto non è più visibile sul fondo del tubo.

Stimare la torbidità approssimativa della soluzione mediante confronto visivo tra la soluzione preparata e gli standard McFarland. Se la torbidità della sospensione batterica sembra essere molto bassa, continuare ad aggiungere altri batteri e a vorticare fino a quando la torbidità approssimativa della soluzione è paragonabile agli standard di McFarland 0,5 e 1. Pellettare i batteri mediante centrifugazione e aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta.

Risospendere il pellet di cellule batteriche in un millilitro di acqua ultrapura con vortice e sedimentare i batteri con un'altra centrifugazione. Dopo aver lavato i batteri fino a tre volte come appena dimostrato, aspirare il surnatante e agitare il pellet per almeno due minuti prima di aggiungere cinque microlitri di cellule sul substrato sperimentale. Se lo spessore desiderato è un monostrato o un singolo batterio, subito dopo il deposito, aggiungere tra 20 e 100 microlitri di acqua ultrapura al substrato e mescolare delicatamente la soluzione con un puntale per pipetta.

Quando il campione si è asciugato all'aria, utilizzare del nastro biadesivo per montare il substrato su un disco per campioni in metallo AFM. Per preparare lo strumento di spettroscopia AFM-IR per un'analisi, premere Inizializza dopo aver acceso il software e il laser e confermare che l'otturatore laser sia in posizione aperta. Durante questo processo, verrà visualizzata la finestra Inizializzazione fase.

Al termine del processo di inizializzazione, fare clic su Inizializza e su OK. Se possibile, attivare il flusso di azoto per spurgare lo strumento con azoto e regolare lo spurgo dell'azoto per ottenere un livello di umidità stabile. Posizionare con cautela il campione nella camera del campione senza danneggiare la punta e fare clic su Carica nel software. Segui la procedura guidata per caricare il campione, concentrandoti sulla punta e sul campione in ogni passaggio.

Quindi fare clic su Approccio per avvicinarsi al campione senza interagire. Prima di attivare l'esempio, selezionare Strumenti, Calibrazione sfondo IR e Nuovo. Nella finestra pop-up, impostare la risoluzione e la gamma spettrale in base all'obiettivo dell'analisi e impostare le co-medie e gli sfondi su valori medi.

Seleziona Abilita. Nella finestra popup, impostare i parametri di inizio e fine e fare clic su Accetta e acquisisci. Una volta acquisiti i dati in background, fare clic su Salva.

Per agganciare la punta al campione, fare clic su Interagisci. Il sistema si avvicinerà alla superficie del campione fino a quando non verrà rilevato un contatto diretto. Fare clic su Scansione per raccogliere un'immagine AFM iniziale con un'area più ampia e una risoluzione spaziale bassa per visualizzare la superficie prima di spostare la punta in un punto di misurazione di interesse.

Per allineare il laser a infrarossi a un numero d'onda al quale il campione verrà assorbito, immettere il numero d'onda al quale il campione verrà assorbito nel campo Numero d'onda e fare clic su Avvia IR.At dovrebbe essere osservato almeno un picco chiaro nel grafico Ampiezza rispetto alla frequenza. Il grafico Deflessione rispetto al tempo dovrebbe mostrare una forma d'onda periodica. Fare clic su Ottimizza per selezionare uno spettro di batteri a infrarossi convenzionale per identificare le posizioni delle bande e utilizzare lo spettro per ottimizzare gli hotspot a vari valori del numero d'onda da varie regioni spettrali.

Quando gli spot infrarossi per i valori del numero d'onda selezionati sono stati ottimizzati, definire la risoluzione spettrale e l'intervallo e il numero di co-medie e fare clic su Acquisisci per raccogliere lo spettro AFM-IR. Per raccogliere un'immagine di distribuzione dell'intensità per un valore del numero d'onda selezionato, dopo aver registrato un singolo spettro AFM-IR, registrare un'immagine AFM dell'area campione selezionata e selezionare i valori del numero d'onda per l'imaging AFM-IR. Verificare che il punto IR del laser sia stato ottimizzato per i valori del numero d'onda selezionati e impostare il numero di punti dati nelle direzioni X e Y dell'area dell'immagine.

Nella finestra Generale, impostare la potenza del laser. Nella finestra Scansione AFM, definire la velocità di scansione. Quindi seleziona la casella Abilita imaging IR e fai clic su Scansione per iniziare l'imaging.

L'AFM-IR dell'intensità del segnale al numero d'onda selezionato verrà raccolto contemporaneamente ai dati AFM da quell'area. Questo protocollo consente l'acquisizione di una gamma di tipi di distribuzioni cellulari batteriche su un substrato, dalle singole cellule ai monostrati e ai multistrati. Il protocollo può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici nei batteri viventi.

Ad esempio, nella formazione di un setto durante la divisione cellulare di S.aureus. Lo spettro AFM-IR del setto era caratterizzato da una maggiore intensità relativa delle bande a 1, 240 e 1.090 centimetri rispetto agli spettri AFM-IR raccolti dall'area cellulare, suggerendo che il setto è costituito da gruppi di carboidrati e fosfodiestere dei componenti della parete cellulare. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare le differenze nella composizione chimica derivanti dallo sviluppo della resistenza.

Come osservato in questa analisi rappresentativa, non sono state misurate differenze morfologiche tra la resistenza intermittente alla vancomicina e le cellule di S.aureus sensibili alla vancomicina. La valutazione degli spettri AFM-IR e dei loro secondi derivati, tuttavia, ha rivelato un chiaro aumento dell'intensità relativa delle bande associate ai gruppi carboidrato e fosfodiestere dai componenti della parete cellulare nel ceppo resistente rispetto alla controparte suscettibile. È importante preparare un campione pulito, quindi fare attenzione a ridurre l'apporto medio fin dall'inizio e a rimuoverlo completamente da più lavaggi.

Poiché l'AFM-IR è una tecnica non distruttiva, il campione può essere successivamente studiato con altre tecniche, come la colorazione o la spettroscopia ionica confocale, che possono fornire informazioni complementari sulla loro chimica.