Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi
23 febbraio 2021
La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.
La purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con il sequenziamento dell'RNA o MAPS è stata sviluppata per identificare l'intero targetome di qualsiasi RNA di interesse per i batteri. Questa tecnologia consente di identificare qualsiasi tipo di partner sRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. La caratterizzazione delle reti normative dipendenti dall'sRNA aiuterà a comprendere meglio la produzione di fattori di virulenza, la formazione di biofilm e la sopravvivenza dei batteri all'interno delle cellule ospiti e, in ultima analisi, a combattere le infezioni stafilococco.
Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi batterio gram-positivo patogeno o non patogeno. A dimostrare la procedura sarà Noemie Mercier, dottoranda del laboratorio del Dr.Pascal Romby. Per iniziare, far crescere una colonia di ceppi che trasportano pCN51 P3 MS2 sRNA o pCN51 P3 MS2 plasmidi in tre millilitri di mezzo BHI integrati con 10 microgrammi per microliterero eriomicina in duplicati.
Diluire ogni coltura notturna in 50 millilitri di mezzo BHI fresco integrato con eringomicina per raggiungere un OD 600 di 0,05. Fai crescere le colture a 37 gradi Celsius tremando a 180 giri/min per sei ore. Trasferire ogni coltura in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il supernatante, congelarli e conservarli a meno 80 gradi Celsius o mantenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle.
Per eseguire la lisi cellulare meccanica, resuspend pellets in cinque millilitri di tampone A e trasferire le cellule rimescolate in tubi di centrifuga da 15 millilitri con 3,5 grammi di perline di silice. Inserire i tubi in uno strumento dilisi a celle meccaniche ed eseguire un ciclo di 40 secondi a quattro metri al secondo. Centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti, quindi recuperare il supernatante e tenerlo sul ghiaccio.
Assicurarsi che il supernatante sia chiaro, ripetendo la centrifugazione in caso di allora. Rimuovere la punta della colonna, quindi inserire una colonna cromatografica in un rack di colonne e lavare la colonna con acqua ultrapura. Aggiungere 300 microlitri di resina amilosio e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Diluire 1.200 picamoli di proteine MBP-MS2 in sei millilitri del tampone A e caricarla nella colonna.
Lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Next, eseguire la purificazione dell'affinità MS2. Caricare il lisato della cella nella colonna e raccogliere la frazione flow-through in un tubo di raccolta pulito. Lavare la colonna tre volte con 10 millilitri di tampone A e raccogliere la frazione di lavaggio, quindi eludere la colonna con un millilitro di tampone E e raccogliere la frazione di eluizione in un microtubo da due millilitri.
Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA. Utilizzare un millilitro di ogni frazione per l'estrazione dell'RNA. Aggiungere un volume di fenolo all'RNA e mescolare vigorosamente, quindi centrifugare la miscela a 16.000 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius.
Trasferire la fase superiore in un microtubo pulito da due millilitri. Aggiungere un volume di alcol isoamilico cloroformio e ripetere la centrifugazione, quindi trasferire la fase superiore in un nuovo tubo. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo al 100% e 0,1 volume di tre acetati di sodio molare a pH 5,2 e precipitare durante la notte a meno 20 gradi Celsius.
Il giorno successivo, centrifuga i tubi per 15 minuti a 16.000 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere lentamente l'etanolo con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo all'80% e centrifuga per cinque minuti.
Scartare l'etanolo tubazione lentamente, quindi asciugare il pellet utilizzando un concentratore sottovuoto per cinque minuti in modalità di corsa. Rimescolare il pellet in un volume appropriato di acqua ultrapura. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare il targetome RsaC in S.aureus.
Diversi mRNA che interagiscono direttamente con RsaC sono stati identificati utilizzando la tecnologia MAPS, rivelando il suo ruolo cruciale nello stress ossidativo e nelle risposte correlate ai metalli. Per confermare i costrutti di sRNA MS2 e visualizzare il loro modello di espressione, le cellule sono state raccolte dopo due, quattro e sei ore di crescita nel mezzo BHI. L'RNA è stato estratto e l'analisi della macchia settentrionale è stata eseguita utilizzando la sonda DIG specifica di RsaC.
Il livello di RsaC endogena è aumentato significativamente dopo sei ore di crescita. È importante sottolineare che il livello di MS2-RsaC 544 e MS2-RsaC 1, 116 era paragonabile a rsac endogeno a sei ore. La purificazione dell'affinità è stata eseguita e gli RRNA sono stati estratti dalle frazioni di estrazione grezza, flusso-through ed eluizione nel ceppo di tipo selvaggio che esprime solo il tag MS2 e il ceppo RsaC mutante che esprime il costrutto MS2-RsaC 544.
L'RsaC endogeno lungo 1.116 nucleotidi fu arricchito nella frazione di eluizione, ma interagiva non specificamente con la colonna di affinità a causa della sua lunghezza e della complessa struttura secondaria. L'MS2-RsaC 544 è stato altamente arricchito nella frazione di eluizione dimostrando che è stato mantenuto con successo dalla proteina di fusione MS2-MBP. Un'analisi bioinformatica ha rivelato obiettivi putativi di mRNA in base al cambiamento di piegatura tra il controllo MS2 sRNA e MS2, indicando che sodA era il primo bersaglio putativo.
Un'analisi della macchia settentrionale eseguita su sonda DIG specifica di sodA dopo la purificazione dell'affinità MS2 mostra che sodA è stato efficacemente co-arricchito con MS2-RsaC 544 rispetto al controllo MS2. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'aggiunta del tag MS2 può influire sulla conferma, la stabilità o la funzione dell'sRNA. Questo dovrebbe essere attentamente monitorato.
MAPS fornisce un'istantanea dell'accoppiamento di bersagli sRNA-RNA. Un'ulteriore convalida sperimentale svelerà la loro funzione. Questa tecnica rappresenta un potente strumento per costruire reti di regolazione dell'sRNA in qualsiasi batterio.
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Panoramica
La tecnologia MAPS consente l'identificazione del targetoma di specifiche RNA regolatorie in vivo, in particolare nei batteri Gram-positivi. Questo metodo utilizza la purificazione per affinità MS2 e il sequenziamento dell'RNA per co-purificare e identificare i partner a RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Biologia dell'RNA
Sfondo
- Comprendere le reti regolatorie dipendenti dagli sRNA è fondamentale per lo studio del comportamento batterico.
- L'identificazione dei partner RNA può chiarire il ruolo dei fattori di virulenza e della formazione di biofilm.
- La tecnologia MAPS consente l'identificazione indipendente dei partner degli sRNA.
- Questo protocollo è applicabile sia a batteri Gram-positivi patogeni che non patogeni.
Scopo dello studio
- Caratterizzare le reti regolatorie dipendenti da sRNA nei batteri.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di sopravvivenza batterica all'interno delle cellule ospiti.
- Sviluppare strategie contro le infezioni stafilococciche.
Metodi Utilizzati
- Purificazione con affinità per MS2 abbinata a sequenziamento dell'RNA.
- Crescita di ceppi batterici in mezzo BHI con eritromicina.
- Copurificazione di sRNA e dei suoi partner per l'analisi.
- Identificazione dei partner di RNA mediante tecniche di sequenziamento.
Risultati principali
- Identificazione riuscita dei partner di sRNA in batteri Gram-positivi.
- Informazioni sulle reti regolatorie che influenzano la virulenza e la sopravvivenza.
- Dimostrazione del protocollo da parte di uno studente di dottorato del laboratorio del Dottor Pascal Romby.
- Potenziali applicazioni nel combattere le infezioni batteriche.
Conclusioni
- La tecnologia MAPS è uno strumento potente per lo studio delle interazioni dell'RNA.
- Comprendere le reti di sRNA può portare a strategie terapeutiche migliori.
- Questo metodo può essere adattato per diverse specie batteriche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnologia MAPS consente un'analisi completa del targetoma di piccoli RNA regolatori in patogeni Gram-positivi, supportando la validazione degli obiettivi nella scoperta di antimicrobici. Rivelando le interazioni sRNA-mRNA che influenzano la virulenza e la sopravvivenza, essa fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per programmi antibatterici nelle fasi iniziali. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella selezione di target sRNA per interventi terapeutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle reti regolatorie dipendenti da sRNA per chiarire ipotesi terapeutiche nei batteri Gram-positivi.
- Valore operativo: Fornisce un'istantanea dei targetomi di sRNA per supportare la riduzione del rischio biologico e la validazione funzionale dei target.
- Valore scientifico: Identifica potenziali target di mRNA come sodA, collegando l'attività delle sRNA a percorsi di stress ossidativo e di risposta ai metalli.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di sequenziamento dell'RNA da frazioni co-purificate per consentire l'identificazione riproducibile di bersagli.
- Valore operativo: Standardizza il catturaggio mediante fusione MS2-MBP su resina amilosica, favorendo la scalabilità del saggio in ceppi Gram-positivi.
- Valore scientifico: Fornisce metriche di arricchimento (ad esempio, frazione di eluizione) per distinguere interazioni specifiche da quelle non specifiche dell'RNA.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i regoloni di sRNA a output fenotipici come la produzione di fattori di virulenza e la formazione di biofilm in Staphylococcus aureus.
- Valore operativo: Supporta l'allineamento traslazionale dei biomarcatori collegando l'attività delle sRNA a vie di risposta allo stress rilevanti per l'infezione.
- Valore scientifico: Facilita decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, convalidando bersagli di sRNA mediante metodi ortogonali come il Northern blot.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
MAPS si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per programmi antibatterici mirati alla regolazione basata sull'RNA.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione degli sRNA mappando gli interattomi di RNA in vivo in condizioni di crescita definite.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di lisi, cattura per affinità ed estrazione di RNA, compatibili con il sequenziamento.
- Analisi: Fornisce misurazioni del fold-change tra le frazioni MS2-sRNA e quelle di controllo per selezionare i bersagli con maggiore affidabilità da analizzare successivamente.
- Ricerca traslazionale: Collega i targetomi degli sRNA ai meccanismi di sopravvivenza dell'ospite, fornendo indicazioni per la validazione preclinica di strategie anti-infettive.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo dei targetomi di sRNA in specie Gram-positive patogene e non patogene.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'identificazione dei bersagli degli sRNA, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella regolazione post-trascrizionale.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dell'isolamento delle interazioni RNA-proteina in lisati batterici.
- Valore strategico: Decisioni più informate sui progetti da avviare o abbandonare nella selezione di bersagli antimicrobici, efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei bersagli di sRNA basata su dati di arricchimento e correlazione fenotipica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in clonaggio molecolare, coltura batterica e manipolazione dell'RNA.
- Necessita di infrastrutture per la lisi meccanica, sistemi di cromatografia e capacità di sequenziamento dell'RNA.
- Esige una standardizzazione tra team per la progettazione dei costrutti (ad esempio, fusioni MS2-sRNA) e la validazione dell'espressione.
- Richiede considerazioni adattative sulla stabilità e sulla struttura secondaria delle sRNA quando applicate a diversi modelli Gram-positivi.
- Limite pratico: i bersagli putativi richiedono una validazione ortogonale (ad esempio, Northern blot) per confermare la specificità a causa di possibili interazioni non specifiche.
