Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Il microambiente consente una concentrazione e una composizione altamente complesse e dinamiche, tra cui citochine in continua evoluzione, concentrazione e composizione dei ligandi. Creare un ambiente di coltura simile è fondamentale per gli studi in vitro su macchinari di vita complessi come la differenziazione delle cellule staminali, le risposte immunitarie e lo sviluppo di organi su piattaforme di chip. Ma generare e fornire segnali chimici di volume nanolitro e precisione millisecondi è difficile usando approcci biomedici convenzionali come la pipettazione.

Per affrontare le sfide, una piattaforma culturale in grado di alternare la generazione di acquisizione di immagini di ingressi di segnale combinatoriali e sequenziali dinamici è molto richiesta. In questo protocollo viene presentata la procedura di progettazione e fabbricazione di un dispositivo microfluidico. Il chip microfluidico proposto è costituito da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e modulo di miscelazione in loco.

Dimostriamo che la piattaforma è adatta per studi su singole cellule popolazioni cellulari bidimensionali e sfere neurali tridimensionali. Le condizioni ambientali complesse e dinamiche sul chip hanno grandi effetti sulla differenziazione delle cellule staminali neurali e sull'autori rinnovamento. I dettagli delle procedure di progettazione e fabbricazione sono i seguenti.

La progettazione dei chip è stata eseguita utilizzando il software AutoCAD. Per adattarsi alle dimensioni del supporto della piastra al microscopio, il chip microfluidico ha dimensioni di circa sette per cinque centimetri E consiste di 1.500 camere di coltura. Una delle caratteristiche importanti è che ha una pompa peristaltica che consiste di otto canali di flusso e canali di controllo larghi 200 micrometri.

L'aumento dell'area sovrapposta tra controllo e canale di flusso aumenta di 16 volte rispetto alla pompa peristaltica, proposta da Stephen Quake nel 2002, a circa 15 nanolitri liquidi e per ciclo di pompaggio e sufficiente la necessità di mantenere 1.500 condizioni ambientali indipendenti parallelamente sul chip. Un'altra parte importante del dispositivo è una camera di coltura a due strati, in grado di mantenere un ambiente di coltura privo di taglio. La sollecitazione di taglio indesiderata viene impedita indirizzandola rapidamente attraverso lo strato superiore.

Le cellule, i tessuti e il mezzo condizionale cruciale rimangono intatti allo strato inferiore. La simulazione numerica suggerisce che quando i liquidi sono diretti attraverso camere di coltura, da sinistra a destra. le forze di taglio possono essere efficacemente prevenute.

Anche ad una portata di ingresso di 10 millimetri al secondo la cellula o il tessuto delle dimensioni di un micrometro rimangono indisturbati nella parte inferiore dell'unità di coltura. Abbiamo fabbricato lo stampaggio replica o il wafer di silicio utilizzando la litografia UV. I canali fluidici di 25 micrometri di altezza e 100 micrometri di peso sono prodotti utilizzando fotoresist negativo SU-8 3025.

Le camere di coltura di 75 micrometri e 150 micrometri di altezza sono state fabbricate utilizzando fotoresist SU-8 3075. Il fotoresist positivo AZ50X viene utilizzato per le caratteristiche del pozzo a forma rotonda che si sovrappongono ai canali di controllo per garantire una buona connessione. Per produrre il chip microfludico, i wafer di silicio fantasia e vuoto sono stati trattati in primo luogo con TMCS.

Diverse quantità di PDMS da 10 a 1 di rapporto monomero/catalizzatore sono state accuratamente miscelate e sfatate per una o due ore nella camera a vuoto a meno 0,85 megapascal. Lo strato di controllo è stato ottenuto dal rivestimento di spin PDMS a 2.200 giri/min. I wafer di silicio sono stati quindi trasferiti in incubatrice e incubati per 60 minuti a 80 centigradi.

Diversi strati sono stati allineati e incollati insieme utilizzando un dispositivo ottico personalizzato e una macchina per l'incisione al plasma. I fori di ingresso sono stati poi perforati dopo altre due ore di legame termico a 80 centigradi. Il chip è stato incollato a uno scivolo di copertura rivestito in PDMS, che ha le stesse dimensioni di una piastra da 96 pozzi e polimerizzato per almeno 12 ore a 80 centrigradi prima dell'uso.

Per il funzionamento, i canali di controllo sono stati collegati a valvole solenoidi pneumatiche in miniatura attraverso tubi di plastica. La tornitura di tutti i pozzi penumatici è stata controllata da un programma MATLAB personalizzato attraverso l'interfaccia utente grafica. Le pressioni di chiusura ottimali delle valvole a membrana PDMS push-up sono state determinate individualmente per ogni chip, che in genere varia da 25 a 30 PSI.

Ruotando dinamicamente tutte le serie di pozzi, è possibile generare input combinatoriali e sequenziali su chip. Le cellule sono state raccolte all'80% di confluenza e rimostrate con dmem mezzo di coltura ad una densità di circa 10 alla potenza sei per millilitro, che sono state poi caricate nel chip pressurizzando la soluzione contenente la cella. Sia per le cellule staminali aderenti che per le sospensioni delle cellule staminali neurologiche, le cellule sono state raccolte e le sfere sono state direttamente caricate nel chip.

Per l'acquisizione di immagini, è stato utilizzato un microscopio invertito con uno stadio trasmittente automatico e la fotocamera digitale complementare a semiconduttore metallo-ossido. Lo stadio e l'acquisizione dell'immagine sono stati controllati tramite il software mostra l'angolo in alto a sinistra e le camere d'angolo in basso a destra come punti di selezione e spostare lo stadio traslazionale ai punti in modo ordinato per ottenere l'imaging preliminare con obiettivo 4x. Cambia l'obiettivo 4x con quello 20x e regola i parametri di imaging tra cui intensità della luce, tempo di esposizione, eccetera.

Quindi individuare i punti di selezione in modo che la posizione di ogni camera che esce da una matrice di camera 13 per 15 o sia definita automaticamente dal programma. Con la determinazione delle coordinate delle camere, lo stadio tras traslizionale si sposta in ogni camera in cui il piano focale X, Y, Z può essere messo a punto. Impostare l'intervallo e la durata del ciclo di imaging.

Salvare il percorso e quindi iniziare l'imaging. Questo sistema è disponibile per vari tracciamenti dinamici bersaglio, come la differenziazione delle cellule staminali neurali in campo luminoso e il campo di fluorescenza del processo di formazione delle cellule staminali neurali. analisi dei dati.

Modificate il formato in nd2 in Tif utilizzando il programma MATLAB personalizzato. E dividere i dati in base ai punti. L'oggetto selezionato da analizzare è cellula o tessuto.

Immettere la soglia, le dimensioni dell'oggetto, le dimensioni del rumore per l'analisi. Oppure è possibile scegliere l'analisi passo-passo per parametri ottimali. E poi analizzando tutti i dati.

Dopo aver salvato il risultato in formato MAT, utilizzando il plottaggio per disegnare i risultati o le tracce. In questo articolo, abbiamo descritto il protocollo e la coltura del sistema di chip microfluidici ad alta produttività basato sulla tecnologia della fotolitografia per il controllo dinamico del microambiente a cellule vive. Abbiamo anche descritto alcuni parametri che si dovrebbero controllare attentamente come la pressione di chiusura delle valvole a membrana PDMS e il controllo dello spin del fluido in parallelo della camera.

Nella coltura cellulare tradizionale in vitro il trattamento dell'ambiente di coltura cellulare viene eseguito manuale, che richiede molto tempo e laborioso e riempito di liquidi non è facile da controllare standard. In particolare minuti di soluzione. Ci sono alcuni problemi come generare input, concentrazione di farmaci immunitari e grande consumo.

Tuttavia, utilizzando il nostro sistema microfluidico, è possibile ripeterlo come stimolatore a una dose fissa singolo fluido uguale quantità di concentrazione uniforme, confrontare culture diverse in diverse camere di coltura allo stesso tempo. Diverso con qualche stimolo posteriore a risoluzione temporale in miniatura e con la sottoimpostazione della risoluzione regolando il fluido. Inoltre, il nostro sistema può ottenere un gran numero di risultati sperimentali comparativi con semplici operazioni.

Il nostro sistema si basa sul principio della diffusione, crea un minimo disturbo meccanico al microambiente cellulare. Per chip di microambiente cellulare più stabili è possibile aumentare l'elenco del livello tampone come profondità del livello di coltura o ridurre il fluido di input dello scambio medio, o cioè ridurre la pressione, che sarà qui per la ricerca sul comportamento cellulare. Va notato che questo studio ha esaminato solo la coltura delle cellule 3T3 e NSC.

Per altre celle o linee cellulari, le condizioni di coltura paragonabili ai nostri parametri per regolarlo.