Name: Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Scopri la microscopia 4D per ricostruire il lignaggio cellulare di Caenorhabditis elegans durante lo sviluppo embrionale. Questo metodo consente di analizzare ciclo cellulare, proliferazione e apoptosi senza marcatori fluorescenti.

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Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Fondazione Rioja Salud (Fondos FEDER) e del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) spagnolo (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda è finanziata da una borsa di studio dell'AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Coltiva C. elegans su piastre di Petri
<ol><li>Preparare le piastre NGM e seminarle con E. coli OP50 come fonte di cibo (Figura 1). Coltivare e mantenere C. elegans come descritto17. Conservare i piatti seminati a 4 °C per un massimo di un mese.</li>
	<li>Regolare le piastre alla temperatura desiderata prima di aggiungere i vermi.<ol>
<li>Per trasferire i vermi, rimuovere un pezzo di agar da un vecchio piatto e posizionarlo su un piatto fresco.</li>
		<li>In alternativa, cattura singoli animali con un raccoglitore di vermi sterile (un pezzo da 1 pollice di filo di platino calibro 32 con una punta appiattita, montato sulla punta di una pipetta Pasteur) e posizionali sulla nuova piastra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltiva i vermi alla temperatura desiderata.<ol>
<li>Coltivare i vermi C. elegans a 20 °C, la temperatura standard. Tuttavia, per analizzare lo sviluppo di mutanti termosensibili, eseguire un'incubazione notturna, di solito a 25 °C. Regolare la durata e la temperatura di questa incubazione secondo necessità, a seconda del mutante specifico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparare la registrazione al microscopio 4D prima di montare gli embrioni (Figura 2)
<ol><li>Impostare il microscopio e i controlli della temperatura prima di preparare l'embrione. Gli embrioni di C. elegans si dividono molto rapidamente. Preparati a iniziare la registrazione immediatamente dopo aver montato gli embrioni.</li>
	<li>Regolare la temperatura di registrazione a 15 °C, 20 °C o 25 °C.<ol>
<li>Registrare regolarmente gli embrioni a 25 °C. Registrare i mutanti termosensibili alla temperatura restrittiva per mostrare i loro fenotipi. Registrare un controllo WT (se eseguito in una preparazione diversa) alla stessa temperatura dei mutanti. NOTA: gli embrioni WT si sviluppano più velocemente a 25 °C e più lentamente a 15 °C senza ulteriori differenze nella linea cellulare. Posizionare i microscopi in una stanza a temperatura controllata. Un ulteriore controllo mediante raffreddamento o riscaldamento della slitta è altamente desiderabile. Ciò può essere ottenuto facendo circolare l'acqua a una temperatura specifica attraverso un anello metallico attorno all'obiettivo del microscopio e al condensatore. L'obiettivo e la preparazione sono a diretto contatto attraverso l'olio ad immersione e il trasferimento di temperatura è efficiente. Questo sistema consente un controllo preciso della temperatura di registrazione e l'esecuzione di sbalzi di temperatura durante lo sviluppo dell'embrione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i parametri di registrazione nel software di microscopia.<ol>
<li>Per una registrazione standard di C. elegans (senza scansioni fluorescenti), selezionare: z-stack di 30 piani focali, ad una distanza di 1 micron ciascuno. Intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack. 1500 z-stack (12,5 ore di record). NOTA: sia i programmi di controllo del microscopio commerciali che quelli open source possono essere utilizzati per definire questo flusso di lavoro per l'acquisizione di immagini. Ora il microscopio è pronto per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparare e montare gli embrioni
<ol><li>Preparare un tampone di agar sottile e omogeneo come primo passo per ottenere una bella immagine (Figura 3).<ol>
<li>Preparare 50 ml di una soluzione di agar al 4,5% in acqua deionizzata. Riscaldare a ebollizione nel microonde e versare 0,5 – 1 ml in tubi di vetro da 3 ml.</li>
		<li>Sigillare accuratamente i tubi con pellicola di cera per evitare l'essiccazione. I tubi di agar sigillati possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di due mesi.</li>
		<li>Sul banco di laboratorio, avere un blocco di calore a 80 °C con: una provetta di vaselina pura (fusa), con all'interno un pennello fine. una provetta con acqua distillata contenente una pipetta Pasteur. NOTA: questo assicura che tutti i materiali richiesti saranno caldi e l'agar non si solidificherà nel processo di produzione del pad.</li>
		<li>Rimuovere il film di cera dalla parte superiore di uno dei tubi di agar e riscaldarlo con cura su un bruciatore di alcol per sciogliere l'agar. Prestare attenzione poiché l'agar caldo espulso dal tubo di vetro potrebbe causare ustioni.</li>
		<li>Una volta che l'agar è fuso, posizionare il tubo nel blocco di calore per mantenere l'agar in forma liquida.</li>
		<li>In alternativa, posizionare i tubi di agar nel blocco di calore 1 ora prima dell'esperimento per scioglierli senza utilizzare un bruciatore. L'agar fuso dovrebbe essere scartato dopo un giorno.</li>
		<li>Posizionare un vetrino per microscopio (Slide A) tra altri due su un pezzo di plastica.</li>
		<li>Prendi un'altra diapositiva (Slide B) e tienila con le dita in una mano.</li>
		<li>Con l'altra mano, posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro della diapositiva A usando la pipetta calda Pasteur.</li>
		<li>Premere immediatamente la diapositiva B sulla goccia di agar per creare un cuscinetto molto sottile tra le diapositive A e B. Tenere queste diapositive inserite insieme fino al punto 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare gli embrioni.<ol>
<li>Raccogli 5-10 ermafroditi gravidi con il raccoglitore e mettili in un bicchiere da orologiaio pieno d'acqua.</li>
		<li>Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre le uova precoci (1-4 cellule) dall'utero, sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Prendere la diapositiva dal passaggio 3.1.10 e far scorrere delicatamente la diapositiva B per esporre il tampone di agar sulla diapositiva A.</li>
		<li>Metti un uovo precoce al centro del cuscinetto di agar pipettando con un tubo capillare.</li>
		<li>In alternativa, pipettare una goccia contenente una serie di embrioni sul tampone di agar e quindi cercare embrioni in fase iniziale. Esegui questo passaggio sotto lo stereomicroscopio.</li>
		<li>Se necessario, sposta l'uovo spingendolo con una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua in eccesso con la pipetta capillare. NOTA: Una pipetta capillare può essere facilmente preparata riscaldando una pipetta Pasteur su un bruciatore ad alcool e tirandola da entrambe le estremità.</li>
		<li>Coprire con cura la preparazione con un coverslip. Per evitare bolle d'aria, posizionare un bordo del coperchio sul vetrino e far scorrere delicatamente un bisturi lungo il bordo adiacente per drappeggiare lentamente e obliquamente il coperchio sulla preparazione.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua. Lasciare 1/4 dello spazio con aria.</li>
		<li>Sigillare il coperchio con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione.</li>
		<li>Utilizzare il pennello sottile per estendere un sottile strato di vaselina fusa attorno al bordo del coperchio. NOTA: ora la preparazione è pronta per la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Regolare il DIC e avviare la registrazione al microscopio 4D
<ol><li>Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Focalizzare l'embrione utilizzando l'obiettivo a basso ingrandimento (5x o 10x).</li>
	<li>Passare all'obiettivo di immersione 100x.</li>
	<li>Regolare i componenti ottici del microscopio per ottenere un'immagine di Nomarski.<ol>
<li>Focalizzare il condensatore.</li>
		<li>Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo (questo fornirà un'apertura numerica più elevata e, quindi, una maggiore risoluzione).</li>
		<li>Verificare che entrambi i polarizzatori al microscopio siano orientati per causare la massima estinzione della luce.</li>
		<li>Ruota il prisma di Wollaston per ottenere una bella immagine tridimensionale dell'embrione, illuminata su un lato. Ruota il prisma nella direzione opposta per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato dall'altra parte. NOTA: questi passaggi possono essere eseguiti su un campione di prova prima della registrazione in modo che sia necessaria solo la messa a punto del campione analizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine al microscopio.</li>
</ol>5. Analizzare il filmato 4D (Figura 4).
NOTA: una volta completata la registrazione, utilizzare il software di tracciamento del lignaggio cellulare per ricostruire e analizzare il lignaggio cellulare.
Il software di tracciamento del lignaggio cellulare è un potente strumento per eseguire analisi dettagliate dello sviluppo embrionale o della dinamica in colture cellulari o frammenti di tessuto. Il programma estrae e quantifica diversi set di dati sulla dinamica cellulare del campione che includono la generazione del lignaggio cellulare completo di ogni singola cellula registrata, comprese le divisioni cellulari, la lunghezza del ciclo cellulare, la migrazione o l'apoptosi e la sua cinetica. Inoltre, la differenziazione cellulare può essere segnata dai cambiamenti morfologici della cellula o dall'espressione di marcatori specifici. Fondamentalmente, lo schermo del software visualizza due finestre: nella finestra di sinistra, il filmato 4D può essere riprodotto avanti e indietro o su e giù ai livelli superiore o inferiore in modo che ogni cella possa essere seguita nel tempo e nello spazio durante la registrazione. Sulla vedova destra, viene generato il lignaggio cellulare. Facendo clic su un nucleo cellulare nel filmato 4D si genera un punto nella finestra di lignaggio che memorizza le informazioni del nome della cellula, del destino e delle coordinate spaziali. Il lignaggio cellulare di una cellula specifica viene generato riproducendo il filmato 4D in avanti e facendo clic periodicamente sul nucleo per contrassegnare la mitosi di quella specifica cellula nel tempo. La ripetizione di questo processo per ciascuna delle cellule registrate genera il lignaggio cellulare completo dell'embrione o del campione. Le informazioni memorizzate per le coordinate spaziali di ciascuna cellula vengono successivamente utilizzate per ricostruire modelli embrionali 3D e percorsi di migrazione cellulare.
<ol><li>Apri il software di tracciamento del lignaggio e crea un nuovo progetto andando al menu della barra superiore e selezionando: | file Nuovo progetto.</li>
	<li>Selezionare il modello di derivazione della cella in base alla temperatura di registrazione: DB08 per la registrazione a 25 °C, DB10 per la registrazione a 20 °C e DB12 per la registrazione a 15 °C.</li>
	<li>Impostare i parametri di registrazione nella finestra emergente: conteggio delle scansioni (di solito 1500), tempo tra le scansioni (30 secondi), conteggio dei livelli (30) e distanza tra i livelli (1 micron).</li>
	<li>Selezionare il file immagine e il formato.<ol>
<li>Selezionare la directory delle immagini in cui sono state salvate le immagini.</li>
		<li>Scegli se le immagini devono essere salvate come immagini singole (un'immagine per livello e tempo) o come z-stack multi-immagine.</li>
		<li>Determinare la denominazione dei file e il formato dell'immagine. Di routine, le singole immagini vengono salvate con i seguenti nomi: X0000L00C1 (per scansione 0, livello 0, canale 1) X0000L01C1 (per scansione 0, livello 1, canale 1) X0000L02C1 (per scansione 0, livello 2, canale 1) ... X0001L00C1 (per scansione 1, livello 0, canale 1) X0001L01C1 (per la scansione 1, livello 1, canale 1) ... X0300L04C1 (per scansione 300, livello 4, canale 1) ... NOTA: il salvataggio delle immagini in un formato compresso consente di risparmiare spazio sul disco rigido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire i canali di luce: 1 per l'ottica DIC, 2 per GFP, 3 per RFP, ecc. Aggiungi quelli che sono stati utilizzati nella registrazione 4D. Fare clic su "elaborazione del canale abilitata" per rilevarli.</li>
	<li>Inizia a tracciare il lignaggio cellulare dell'embrione. Lo schermo ora contiene due finestre principali: la finestra video e la finestra di lignaggio cellulare.<ol>
<li>Nella finestra di lignaggio, selezionare un ramo di lignaggio e utilizzare il mouse per fare clic sul nucleo della cella corrispondente a questa cella nella finestra video.</li>
		<li>Segui la cella spazialmente e nel tempo riproducendo il filmato 4D in avanti, indietro o su o giù per un livello, usando i tasti cursore.</li>
		<li>Fare periodicamente clic sul nucleo cellulare. Questo genera un punto nel ramo del lignaggio e registra le coordinate spaziali della cellula in questo momento. Di conseguenza, il lignaggio cellulare progredisce e sono possibili ricostruzioni 3D dell'embrione.</li>
		<li>Contrassegnare la mitosi facendo clic sul tasto Invio. Quindi selezionare una delle celle figlie e seguirla come prima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere il processo (passaggi da 5.6.1 a 5.6.4) per il resto delle cellule embrionali per tracciare l'intero lignaggio cellulare o per seguire cellule specifiche di interesse come quelle sottoposte ad apoptosi.</li>
	<li>Confronta il lignaggio mutante con il lignaggio stereotipato delle cellule WT C. elegans .</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una delle principali sfide della biologia moderna è la comprensione dello sviluppo di organismi multicellulari. C. elegans è emerso come uno dei modelli più adatti per studiare la sottile coordinazione tra proliferazione cellulare e differenziazione cellulare nell'embrione in via di sviluppo. Da un punto di vista ottico, il suo corpo trasparente e le sue piccole dimensioni rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC. Anche altri organismi con caratteristiche simili sono stati sottoposti all'analisi al microscopio 4D 11,12,13,14,15,16.
Per questi studi sullo sviluppo, l'inattivazione genica da parte della genetica in avanti o inversa fornisce un indizio sul suo coinvolgimento nell'embriogenesi. Una volta che un gene ha dimostrato di svolgere un ruolo nello sviluppo, il passo successivo è definire il suo ruolo esatto nella creazione del piano corporeo corretto. L'immunocolorazione è l'approccio selezionato per la maggior parte dei modelli. Questa tecnica chiarisce i problemi nella differenziazione cellulare o nell'espressione di marcatori specifici. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo approccio è che fornisce solo una visione statica dell'espressione di un singolo o più marcatori in un punto fisso dello sviluppo. Una visione dinamica di questi marcatori durante lo sviluppo può essere ottenuta solo colorando diversi embrioni in diversi punti temporali. Inoltre, la ricostruzione del lignaggio cellulare non è possibile in tali campioni fissi.
La microscopia 4D è un approccio complementare per lo studio dello sviluppo embrionale. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo a una risoluzione a livello cellulare. Qualsiasi difetto nell'embrione come problemi nell'orientamento del fuso, migrazione cellulare, apoptosi, specifica del destino cellulare, ecc. Apparirà in un film 4D che può essere visualizzato in avanti e indietro, quantificato e segnato dal ricercatore. Usando questa tecnica, praticamente ogni cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Gli embrioni sottoposti a microscopia 4D con sola luce visibile e ottica Nomarski non subiscono fotodanni. Le scansioni fluorescenti possono anche essere intercalate all'interno della registrazione per rilevare quando e dove viene espresso un gene. Gli embrioni che subiscono un fotodanneggiamento significativo sono identificati dall'estensione del ciclo cellulare che causa una forte irradiazione UV rispetto a un embrione di lignaggio WT standard. In tal caso, il fotodanno può essere ridotto abbassando l'intensità della lampada UV e aumentando la sensibilità della fotocamera o il tempo di esposizione. Le caratteristiche morfologiche e i marcatori molecolari possono aiutare a chiarire lo sviluppo embrionale di qualsiasi mutante.
La creazione di un sistema di microscopia 4D è facile da implementare in laboratorio e, dopo un po 'di pratica, consente un'analisi senza pari della dinamica cellulare e del tracciamento del lignaggio di colture cellulari e campioni trasparenti viventi a un livello di risoluzione di ogni singola cellula nel campo del microscopio. Il tracciamento del lignaggio cellulare sulle immagini DIC viene ancora elaborato a mano. Richiede molto tempo e, sebbene il software rilevi errori di lignaggio come diversi rami di lignaggio che contrassegnano la stessa cella, sono possibili errori. Mentre il rilevamento automatico delle cellule marcate con GFP è ben sviluppato2, il software complementare di tracciamento del lignaggio basato su cellule non contrassegnate e immagini in luce visibile è ancora nella fase iniziale e non è realmente utile per un'analisi completa dell'embrione. Senza alcun dubbio, l'applicazione dei sistemi di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso in questo campo.

La microscopia 4D è un sistema di registrazione time-lapse multifocale che consente ai ricercatori di registrare e quantificare la dinamica cellulare di un campione biologico sia spazialmente che nel tempo. Colture cellulari, lieviti o tessuti viventi possono essere sottoposti ad analisi 4D ma questa tecnica è particolarmente adatta per analizzare lo sviluppo di embrioni viventi. La risoluzione di questa analisi raggiunge il livello di ogni singola cellula dell'embrione. Ogni divisione cellulare può essere rilevata e i movimenti cellulari possono essere tracciati nel tempo. I destini cellulari sono valutati in base alla posizione e alla forma che le cellule acquisiscono. L'uso dell'ottica Nomarski migliora il contrasto di campioni trasparenti non macchiati utilizzando fasci di luce polarizzati ortogonalmente che interferiscono sul piano focale. Le immagini risultanti appaiono tridimensionali, illuminate su un lato.
Altri metodi basati sull'uso della microscopia confocale e degli animali transgenici GFP per il rilevamento automatico dei nuclei e la generazione di lignaggi cellulari sono stati sviluppati 1,2. Il vantaggio di questi sistemi è ovvio: il software ignora di gran lunga la necessità di contrassegnare manualmente ogni nucleo per un periodo di tempo (anche se è necessaria una certa supervisione manuale durante le fasi finali). Tuttavia, i processi cellulari che coinvolgono cambiamenti nella forma cellulare o nella dinamica della membrana, come quelli che si verificano durante la differenziazione cellulare, la migrazione, l'apoptosi o l'inghiottimento di cadaveri, rimangono nascosti come sfondo nero nelle immagini dei nuclei marcati fluorescenti.
Al contrario, la microscopia 4D Nomarski (chiamata anche microscopia DIC, microscopia a contrasto a interferenza differenziale) mostra sia i nuclei che i cambiamenti di forma cellulare che si verificano durante lo sviluppo di animali selvatici o mutanti. Ciò consente il tracciamento del lignaggio cellulare utilizzando microscopi standard, impiegando solo luce trasmessa. Non vi è alcuna necessità generale di utilizzare animali transgenici se non per mostrare modelli di espressione specifici, nel qual caso le scansioni fluorescenti possono essere intercalate. Pertanto, questo potrebbe essere l'approccio ottimale per molti laboratori che lavorano su processi cellulari dinamici come l'embriogenesi o l'apoptosi che possono essere evidenziati sotto la microscopia DIC 3,4,5,6,7.
Sono disponibili diversi programmi flessibili e intuitivi per l'acquisizione di immagini microscopiche e la ricostruzione di lignaggi cellulari, modelli 3D, percorsi di migrazione cellulare, ecc. Nel campione registrato. In un esperimento standard, le immagini vengono acquisite in una serie di piani focali, a una distanza costante, il cui numero dipende dallo spessore del campione. La risoluzione temporale dell'analisi può essere ottimizzata aumentando la frequenza di scansione. Non c'è praticamente alcun limite per la durata della registrazione se non la capacità di archiviazione del computer. Ad esempio, per un'analisi dello sviluppo embrionale di C. elegans , acquisiamo regolarmente immagini su 30 piani focali (1 micron-passo ciascuno), ogni 30 secondi per 12 ore.
Questi sistemi sono stati applicati all'analisi di diversi embrioni animali come Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, altri embrioni di nematodi12,13, tardigradi14,15 e persino embrioni di topo precoci16. L'unico requisito è avere un embrione trasparente in grado di svilupparsi sulla preparazione del vetrino al microscopio.
In sintesi, la microscopia 4D basata su DIC è particolarmente utile per 1) analizzare lo sviluppo embrionale di piccoli animali trasparenti: tracciare il lignaggio cellulare, i percorsi di migrazione cellulare, la generazione di modelli 3D, ecc; 2) definizione dei modelli di espressione genica; 3) studiare le dinamiche di coltura cellulare, dal lievito alle cellule umane; 4) analizzare la dinamica dei tessuti o frammenti embrionali; 5) quantificare la cinetica della morte cellulare e l'inghiottimento del cadavere; e 6) eseguire analisi filogeniche comparative basate sulle caratteristiche dello sviluppo embrionale. Se c'è interesse per uno di questi argomenti (o simili), è possibile utilizzare la microscopia 4D.

<table><tbody><tr><td>Caenorhabditis elegans (N2)</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans ceppo. Può essere richiesto presso GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans ceppo mutante. Può essere richiesto presso GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Software di tracciamento del lignaggio cellulare</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>Questo è il software per ricostruire il lignaggio cellulare dell'embrione. Per una spiegazione dettagliata, consultare: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Telecamera per microscopio</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Telecamera per miscroscopio sia per luce trasmessa che per luce UV</td></tr><tr><td>Software di controllo del microscopio</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>Questo software controlla il microscopio per eseguire l'acquisizione di immagini 4D. Può essere richiesto a: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 B&ouml; r&szlig; um, Germania, Tel: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Software di controllo del microscopio</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>Questo software controlla il microscopio per eseguire l'acquisizione di immagini 4D. Può essere scaricato all'indirizzo: https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>Microscopio motorizzato</td><td>Leica</td><td>DM6000</td><td>Microscopio verticale motorizzato per eseguire la microscopia 4D</td></tr><tr><td>Dotazione standard in un laboratorio di biologia molecolare.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Streromicroscopio per la manipolazione di nematodi e la preparazione di embrioni.</td></tr></tbody></table>

microscopia 4d: svelare lo sviluppo embrionale di caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia nomarski

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

La microscopia 4D è uno strumento inestimabile per svelare il processo di sviluppo embrionale in diversi animali. Negli ultimi decenni, Caenorhabditis elegans è emerso come uno dei migliori modelli per studiare lo sviluppo. Da un punto di vista ottico, le sue dimensioni e il corpo trasparente rendono questo nematode un campione ideale per la microscopia DIC (Differential Interference Contrast o Nomarski). Questo articolo illustra un protocollo per la coltivazione di nematodi C. elegans , la preparazione e il montaggio dei loro embrioni, l'esecuzione di microscopia 4D e tracciamento del lignaggio cellulare. Il metodo si basa su registrazioni time-lapse multifocali di immagini Nomarski e analisi con software specifici. Questa tecnica rivela le dinamiche di sviluppo embrionale a livello cellulare. Qualsiasi difetto embrionale nei mutanti, come problemi nell'orientamento del fuso, nella migrazione cellulare, nell'apoptosi o nella specifica del destino cellulare, può essere rilevato e valutato in modo efficiente. Praticamente ogni singola cellula dell'embrione può essere seguita fino al momento in cui l'embrione inizia a muoversi. Tracciare l'intero lignaggio cellulare di un embrione di C. elegans mediante microscopia DIC 4D è laborioso, ma l'uso di software specifici facilita notevolmente questo compito. Inoltre, questa tecnica è facile da implementare in laboratorio. La microscopia 4D è uno strumento versatile e apre la possibilità di eseguire un'analisi senza precedenti dello sviluppo embrionale.

Per caratterizzare lo sviluppo embrionale di un mutante C. elegans per il gene gsr-1, che codifica per l'enzima glutatione reduttasi, necessario per rigenerare il glutatione ridotto (GSH) e coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi redox nel nematode, abbiamo eseguito la microscopia 4D di un mutante di delezione gsr-1 (tm3574) che è un allele di perdita di funzione che causa un arresto embrionale precoce fenotipo18. Sia i nematodi WT che i nematodi C. elegans mutanti bilanciati gsr-1 (tm3574) sono stati coltivati su piastre NGM seminate con E. coli OP50 come fonte di cibo17. I vermi gsr-1 (tm3574) sono stati cresciuti come eterozigoti a 20 °C per due generazioni e poi i vermi omozigoti segreganti (che sono in grado di crescere fino all'età adulta grazie al carico materno) sono stati spostati a 25 °C per un'incubazione notturna prima dell'analisi embrionale. Le piastre a vite senza fine sono state incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa (Figura 1). I nematodi gravidi sono stati tagliati per estrarre giovani embrioni.
Per confrontare lo sviluppo embrionale del mutante rispetto al WT stereotipato in condizioni identiche, un embrione WT (come controllo) e un embrione gsr-1 (tm3574) sono stati posti sulla stessa preparazione uno accanto all'altro. Il flusso di lavoro della microscopia 4D è stato eseguito su un microscopio verticale motorizzato standard dotato di ottica DIC. I parametri di registrazione selezionati sul programma di controllo del microscopio erano: z-stack di 30 piani focali a 1 micron di distanza ciascuno, intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni z-stack e 1500 z-stacks (12,5 ore di registrazione). La temperatura di registrazione è stata regolata a 25 °C (sia nella stanza che sul palco del microscopio) (Figura 2).
Una volta completata la registrazione, il file di immagini è stato aperto e il lignaggio cellulare è stato ricostruito utilizzando un software di tracciamento del lignaggio facendo clic sui nuclei cellulari mostrati nella finestra video (Figura 4). Il lignaggio di cellule embrionali mutanti gsr-1 (tm3574) tracciato è stato confrontato con il lignaggio WT di C. elegans raffigurato sullo sfondo. Un risultato importante è stato il rilevamento di un progressivo ritardo del ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale. Di conseguenza, gli embrioni mutanti sono stati arrestati in fasi intermedie, mentre gli embrioni WT sono progrediti e infine si sono schiusi come larve.
La preparazione e l'osservazione diretta degli embrioni al microscopio o l'immunocolorazione con anticorpi contro marcatori embrionali tardivi potrebbe rivelare la presenza di un'alta percentuale di embrioni giovani nel mutante rispetto al WT. L'arresto embrionale potrebbe quindi essere dedotto come la spiegazione più plausibile. Tuttavia, la prova diretta e l'esatta quantificazione del ritardo del ciclo cellulare possono essere mostrate e quantificate in modo elegante e semplice solo attraverso un esperimento di microscopia 4D. Altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale come la differenziazione cellulare o l'apoptosi (Figura 5) possono anche essere visualizzate in modo dinamico utilizzando la microscopia 4D che offre un'analisi dettagliata di molteplici aspetti dello sviluppo in un singolo esperimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: Nematodi di C. elegans che crescono in condizioni di laboratorio. I nematodi vengono coltivati su lastre NGM con semi di E. coli, conservati in scatole di cartone e incubati a 15 °C, 20 °C o 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Screenshot del software di registrazione al microscopio 4D. Esempio di due diversi programmi software di controllo del microscopio (A e B). Questi programmi creano flussi di lavoro per controllare il microscopio e l'acquisizione di immagini durante la registrazione al microscopio 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Fotografie seriali della preparazione del tampone di agar e del montaggio dell'embrione di C. elegans che mostra. A. Tubi di agar preparati. B-C. Preparazione del pad di agar. D. Scivolo parzialmente riempito d'acqua. E. Sigillare il vetrino con vaselina. F. Preparazione finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Schermate seriali del software di tracciante del lignaggio cellulare. Il programma consente la ricostruzione del lignaggio cellulare embrionale di un mutante ritardante del ciclo cellulare (a sinistra) e di un embrione WT (a destra) di C. elegans . Un. Un primo passo dello sviluppo. B-C. Lo sviluppo di entrambi gli embrioni progredisce nel tempo. D. L'embrione WT si sviluppa correttamente e inizia l'allungamento mentre il mutante arresta. In tutti i casi il programma visualizza la finestra video e la finestra di lignaggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refrattile di lenticchie di cellule apoptotiche in un embrione wt di C. elegans . Il destino cellulare, definito dalle caratteristiche morfologiche, può essere valutato al microscopio 4D. L'immagine mostra un embrione di C. elegans nella fase del fagiolo. Le cellule viventi mostrano nuclei di forma liscia circondati da un citoplasma granulare. Al contrario, le cellule apoptotiche (frecce gialle) condensano e adottano una forma refrattile simile a una lenticchia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.

Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

La microscopia 4D è uno strumento prezioso per ricostruire l'intero lignaggio cellulare dell'embrione di C.elegans o di qualsiasi altro campione a livello di singola cellula. L'ottica Nomarski può essere utilizzata per evidenziare i cambiamenti di forma cellulare durante lo sviluppo con un microscopio standard e la luce trasmessa senza la necessità di animali transgenici o microscopia a fluorescenza. Il microscopio 4D consente di studiare il ciclo cellulare, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi in C.elegans e in altri sistemi come mammiferi o colture cellulari di tessuti.Il tracciamento della linea cellulare sulle immagini DIC viene eseguito manualmente. Richiede tempo e un po' di pratica per eseguire un'analisi completa dell'embrione. A dimostrare la procedura sarà Begona Ezcurra, un tecnico del nostro laboratorio.Prima di preparare gli embrioni, regolare la temperatura di registrazione del microscopio 4D a 15, 20 o 25 gradi Celsius e impostare il microscopio per registrare 1, 500, 30 pile z sul piano focale a un micron di distanza l'una dall'altra con intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni pila. Successivamente, aliquotare da 500 a 1000 microlitri di agar liquido al 4,5% in provette di vetro da tre millimetri e sigillare accuratamente le provette con un film di cera per evitare l'essiccazione. Per preparare un pad di agar sottile e omogeneo per la registrazione, scaldare accuratamente e aliquotare l'agar su un bruciatore ad alcool fino a quando l'agar non si sarà sciolto e posizionare il tubo in un blocco termico a 80 gradi Celsius.Posizionare un vetrino da microscopio su un pezzo di plastica e utilizzare una pipetta da pascolo in una mano per posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro del vetrino, quindi utilizzare immediatamente l'altra mano per posizionare un secondo vetrino sulla goccia di agar per creare un tampone di agar molto sottile. Per montare gli embrioni, per prima cosa, usa un raccoglitore per trasferire da 5 a 10 ermafroditi gravidi in un bicchiere da orologiaio riempito d'acqua sotto uno stereomicroscopio. Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre da una a quattro uova precoci dall'utero.Sfilare delicatamente il vetrino superiore dal cuscinetto di agar e utilizzare un tubo capillare per posizionare un uovo precoce al centro del tampone. Usa una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti per regolare la posizione dell'uovo secondo necessità e usa la pipetta capillare per rimuovere l'acqua in eccesso. Utilizzare un bisturi per drappeggiare lentamente e obliquamente il vetrino coprioggetto sulla preparazione prima di utilizzare una micropipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua.Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione. Dopo la sigillatura, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio 4D e utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per mettere a fuoco l'embrione. Selezionare l'obiettivo a immersione 100X e mettere a fuoco il condensatore.Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo per ottenere un'apertura numerica più alta e una risoluzione maggiore. Ruotare il prisma di Wollaston per ottenere un'immagine tridimensionale dell'embrione illuminato su un lato, quindi ruotare il prisma nell'altra direzione per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato sull'altro lato e iniziare la registrazione 4D. Per la ricostruzione della linea cellulare di un embrione registrato in un filmato 4D, aprire il software di tracciamento della linea e selezionare File e Nuovo progetto.Selezionare il modello di derivazione cellulare appropriato in base alla temperatura di registrazione e impostare il conteggio delle scansioni su 1500. Il tempo tra le scansioni a 30 secondi, il conteggio dei livelli a 30 e la distanza tra i livelli a un micron. Selezionare il file immagine, il formato e la directory in cui sono state salvate le immagini.Selezionate se le immagini sono state salvate come immagini singole o come z-stack multi-immagine e impostate la denominazione dei file e i formati delle immagini. Quindi fare clic su Elaborazione canali abilitata per rilevare e impostare i canali di luce appropriati del filmato 4D. Per il tracciamento della linea cellulare, avviare il software di tracciamento della linea cellulare.Appariranno una finestra video e una finestra di derivazione cellulare. Nella finestra di derivazione, selezionare il ramo di derivazione e fare clic sul nucleo della cellula corrispondente a questa cella nella finestra video. Riproduci il filmato 4D avanti, indietro, su o giù di un livello per seguire la cella di interesse spazialmente nel tempo.Fare clic periodicamente sul nucleo della cellula per generare un punto nel ramo di lignaggio e per registrare le coordinate spaziali della cellula in un momento specifico. Di conseguenza, sono possibili progressioni della linea cellulare e ricostruzioni 3D dell'embrione. Quindi premere il tasto Invio per contrassegnare la mitosi e selezionare una delle cellule figlie per seguire la progressione cellulare come appena dimostrato.Ripetere l'analisi per il resto delle cellule embrionali per tracciare la linea cellulare completa o per seguire specifiche cellule di interesse, come quelle sottoposte ad apoptosi. Consentire il confronto di lignaggi mutanti di interesse con il lignaggio cellulare stereotipato di C. elegans wild-type. Le piastre a vite senza fine vengono incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa.Una volta completata la registrazione, la linea cellulare può essere ricostruita utilizzando il software di tracciamento della derivazione, come dimostrato. Ad esempio, in questa analisi rappresentativa, il lignaggio cellulare dell'embrione mutante gsr-1 tracciato è stato confrontato con il lignaggio wild-type di C.elegans. Ed è stato rivelato il rilevamento di un progressivo ritardo nel ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale.Di conseguenza, gli embrioni mutanti si arrestavano negli stadi intermedi, mentre gli embrioni wild-type progredivano e infine si schiudevano come larve. Inoltre, altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale, come l'apoptosi, possono essere visualizzate dinamicamente utilizzando la microscopia 4D. Il tracciamento del lignaggio delle immagini DIC deve essere elaborato manualmente.L'elaborazione di cellule non marcate su luce visibile nelle prime fasi di sviluppo non è accurata per l'analisi degli embrioni. L'applicazione del sistema di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso nel campo della biologia dello sviluppo.

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