Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski

La microscopia 4D è uno strumento prezioso per ricostruire l'intero lignaggio cellulare dell'embrione di C.elegans o di qualsiasi altro campione a livello di singola cellula. L'ottica Nomarski può essere utilizzata per evidenziare i cambiamenti di forma cellulare durante lo sviluppo con un microscopio standard e la luce trasmessa senza la necessità di animali transgenici o microscopia a fluorescenza. Il microscopio 4D consente di studiare il ciclo cellulare, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi in C.elegans e in altri sistemi come mammiferi o colture cellulari di tessuti.

Il tracciamento della linea cellulare sulle immagini DIC viene eseguito manualmente. Richiede tempo e un po' di pratica per eseguire un'analisi completa dell'embrione. A dimostrare la procedura sarà Begona Ezcurra, un tecnico del nostro laboratorio.

Prima di preparare gli embrioni, regolare la temperatura di registrazione del microscopio 4D a 15, 20 o 25 gradi Celsius e impostare il microscopio per registrare 1, 500, 30 pile z sul piano focale a un micron di distanza l'una dall'altra con intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni pila. Successivamente, aliquotare da 500 a 1000 microlitri di agar liquido al 4,5% in provette di vetro da tre millimetri e sigillare accuratamente le provette con un film di cera per evitare l'essiccazione. Per preparare un pad di agar sottile e omogeneo per la registrazione, scaldare accuratamente e aliquotare l'agar su un bruciatore ad alcool fino a quando l'agar non si sarà sciolto e posizionare il tubo in un blocco termico a 80 gradi Celsius.

Posizionare un vetrino da microscopio su un pezzo di plastica e utilizzare una pipetta da pascolo in una mano per posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro del vetrino, quindi utilizzare immediatamente l'altra mano per posizionare un secondo vetrino sulla goccia di agar per creare un tampone di agar molto sottile. Per montare gli embrioni, per prima cosa, usa un raccoglitore per trasferire da 5 a 10 ermafroditi gravidi in un bicchiere da orologiaio riempito d'acqua sotto uno stereomicroscopio. Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre da una a quattro uova precoci dall'utero.

Sfilare delicatamente il vetrino superiore dal cuscinetto di agar e utilizzare un tubo capillare per posizionare un uovo precoce al centro del tampone. Usa una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti per regolare la posizione dell'uovo secondo necessità e usa la pipetta capillare per rimuovere l'acqua in eccesso. Utilizzare un bisturi per drappeggiare lentamente e obliquamente il vetrino coprioggetto sulla preparazione prima di utilizzare una micropipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua.

Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione. Dopo la sigillatura, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio 4D e utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per mettere a fuoco l'embrione. Selezionare l'obiettivo a immersione 100X e mettere a fuoco il condensatore.

Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo per ottenere un'apertura numerica più alta e una risoluzione maggiore. Ruotare il prisma di Wollaston per ottenere un'immagine tridimensionale dell'embrione illuminato su un lato, quindi ruotare il prisma nell'altra direzione per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato sull'altro lato e iniziare la registrazione 4D. Per la ricostruzione della linea cellulare di un embrione registrato in un filmato 4D, aprire il software di tracciamento della linea e selezionare File e Nuovo progetto.

Selezionare il modello di derivazione cellulare appropriato in base alla temperatura di registrazione e impostare il conteggio delle scansioni su 1500. Il tempo tra le scansioni a 30 secondi, il conteggio dei livelli a 30 e la distanza tra i livelli a un micron. Selezionare il file immagine, il formato e la directory in cui sono state salvate le immagini.

Selezionate se le immagini sono state salvate come immagini singole o come z-stack multi-immagine e impostate la denominazione dei file e i formati delle immagini. Quindi fare clic su Elaborazione canali abilitata per rilevare e impostare i canali di luce appropriati del filmato 4D. Per il tracciamento della linea cellulare, avviare il software di tracciamento della linea cellulare.

Appariranno una finestra video e una finestra di derivazione cellulare. Nella finestra di derivazione, selezionare il ramo di derivazione e fare clic sul nucleo della cellula corrispondente a questa cella nella finestra video. Riproduci il filmato 4D avanti, indietro, su o giù di un livello per seguire la cella di interesse spazialmente nel tempo.

Fare clic periodicamente sul nucleo della cellula per generare un punto nel ramo di lignaggio e per registrare le coordinate spaziali della cellula in un momento specifico. Di conseguenza, sono possibili progressioni della linea cellulare e ricostruzioni 3D dell'embrione. Quindi premere il tasto Invio per contrassegnare la mitosi e selezionare una delle cellule figlie per seguire la progressione cellulare come appena dimostrato.

Ripetere l'analisi per il resto delle cellule embrionali per tracciare la linea cellulare completa o per seguire specifiche cellule di interesse, come quelle sottoposte ad apoptosi. Consentire il confronto di lignaggi mutanti di interesse con il lignaggio cellulare stereotipato di C. elegans wild-type. Le piastre a vite senza fine vengono incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa.

Una volta completata la registrazione, la linea cellulare può essere ricostruita utilizzando il software di tracciamento della derivazione, come dimostrato. Ad esempio, in questa analisi rappresentativa, il lignaggio cellulare dell'embrione mutante gsr-1 tracciato è stato confrontato con il lignaggio wild-type di C.elegans. Ed è stato rivelato il rilevamento di un progressivo ritardo nel ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale.

Di conseguenza, gli embrioni mutanti si arrestavano negli stadi intermedi, mentre gli embrioni wild-type progredivano e infine si schiudevano come larve. Inoltre, altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale, come l'apoptosi, possono essere visualizzate dinamicamente utilizzando la microscopia 4D. Il tracciamento del lignaggio delle immagini DIC deve essere elaborato manualmente.

L'elaborazione di cellule non marcate su luce visibile nelle prime fasi di sviluppo non è accurata per l'analisi degli embrioni. L'applicazione del sistema di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso nel campo della biologia dello sviluppo.