Microscopia 4D: svelare lo sviluppo embrionale di Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia Nomarski
8 ottobre 2020
Qui, presentiamo un protocollo per preparare e montare embrioni di Caenorhabditis elegans , registrare lo sviluppo al microscopio 4D e tracciare il lignaggio cellulare.
La microscopia 4D è uno strumento prezioso per ricostruire l'intero lignaggio cellulare dell'embrione di C.elegans o di qualsiasi altro campione a livello di singola cellula. L'ottica Nomarski può essere utilizzata per evidenziare i cambiamenti di forma cellulare durante lo sviluppo con un microscopio standard e la luce trasmessa senza la necessità di animali transgenici o microscopia a fluorescenza. Il microscopio 4D consente di studiare il ciclo cellulare, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi in C.elegans e in altri sistemi come mammiferi o colture cellulari di tessuti.
Il tracciamento della linea cellulare sulle immagini DIC viene eseguito manualmente. Richiede tempo e un po' di pratica per eseguire un'analisi completa dell'embrione. A dimostrare la procedura sarà Begona Ezcurra, un tecnico del nostro laboratorio.
Prima di preparare gli embrioni, regolare la temperatura di registrazione del microscopio 4D a 15, 20 o 25 gradi Celsius e impostare il microscopio per registrare 1, 500, 30 pile z sul piano focale a un micron di distanza l'una dall'altra con intervalli di 30 secondi tra l'inizio di ogni pila. Successivamente, aliquotare da 500 a 1000 microlitri di agar liquido al 4,5% in provette di vetro da tre millimetri e sigillare accuratamente le provette con un film di cera per evitare l'essiccazione. Per preparare un pad di agar sottile e omogeneo per la registrazione, scaldare accuratamente e aliquotare l'agar su un bruciatore ad alcool fino a quando l'agar non si sarà sciolto e posizionare il tubo in un blocco termico a 80 gradi Celsius.
Posizionare un vetrino da microscopio su un pezzo di plastica e utilizzare una pipetta da pascolo in una mano per posizionare una piccola goccia di agar fuso al centro del vetrino, quindi utilizzare immediatamente l'altra mano per posizionare un secondo vetrino sulla goccia di agar per creare un tampone di agar molto sottile. Per montare gli embrioni, per prima cosa, usa un raccoglitore per trasferire da 5 a 10 ermafroditi gravidi in un bicchiere da orologiaio riempito d'acqua sotto uno stereomicroscopio. Usa un bisturi per aprire i nematodi ermafroditi ed estrarre da una a quattro uova precoci dall'utero.
Sfilare delicatamente il vetrino superiore dal cuscinetto di agar e utilizzare un tubo capillare per posizionare un uovo precoce al centro del tampone. Usa una ciglia incollata all'estremità di uno stuzzicadenti per regolare la posizione dell'uovo secondo necessità e usa la pipetta capillare per rimuovere l'acqua in eccesso. Utilizzare un bisturi per drappeggiare lentamente e obliquamente il vetrino coprioggetto sulla preparazione prima di utilizzare una micropipetta per riempire 3/4 dello spazio che circonda il tampone di agar con acqua.
Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con vaselina per evitare l'essiccazione durante lunghi periodi di registrazione. Dopo la sigillatura, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio 4D e utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per mettere a fuoco l'embrione. Selezionare l'obiettivo a immersione 100X e mettere a fuoco il condensatore.
Aprire completamente l'apertura del condensatore e chiudere il diaframma di campo per ottenere un'apertura numerica più alta e una risoluzione maggiore. Ruotare il prisma di Wollaston per ottenere un'immagine tridimensionale dell'embrione illuminato su un lato, quindi ruotare il prisma nell'altra direzione per ottenere l'effetto di avere l'embrione illuminato sull'altro lato e iniziare la registrazione 4D. Per la ricostruzione della linea cellulare di un embrione registrato in un filmato 4D, aprire il software di tracciamento della linea e selezionare File e Nuovo progetto.
Selezionare il modello di derivazione cellulare appropriato in base alla temperatura di registrazione e impostare il conteggio delle scansioni su 1500. Il tempo tra le scansioni a 30 secondi, il conteggio dei livelli a 30 e la distanza tra i livelli a un micron. Selezionare il file immagine, il formato e la directory in cui sono state salvate le immagini.
Selezionate se le immagini sono state salvate come immagini singole o come z-stack multi-immagine e impostate la denominazione dei file e i formati delle immagini. Quindi fare clic su Elaborazione canali abilitata per rilevare e impostare i canali di luce appropriati del filmato 4D. Per il tracciamento della linea cellulare, avviare il software di tracciamento della linea cellulare.
Appariranno una finestra video e una finestra di derivazione cellulare. Nella finestra di derivazione, selezionare il ramo di derivazione e fare clic sul nucleo della cellula corrispondente a questa cella nella finestra video. Riproduci il filmato 4D avanti, indietro, su o giù di un livello per seguire la cella di interesse spazialmente nel tempo.
Fare clic periodicamente sul nucleo della cellula per generare un punto nel ramo di lignaggio e per registrare le coordinate spaziali della cellula in un momento specifico. Di conseguenza, sono possibili progressioni della linea cellulare e ricostruzioni 3D dell'embrione. Quindi premere il tasto Invio per contrassegnare la mitosi e selezionare una delle cellule figlie per seguire la progressione cellulare come appena dimostrato.
Ripetere l'analisi per il resto delle cellule embrionali per tracciare la linea cellulare completa o per seguire specifiche cellule di interesse, come quelle sottoposte ad apoptosi. Consentire il confronto di lignaggi mutanti di interesse con il lignaggio cellulare stereotipato di C. elegans wild-type. Le piastre a vite senza fine vengono incubate all'interno di scatole di cartone per evitare la condensa.
Una volta completata la registrazione, la linea cellulare può essere ricostruita utilizzando il software di tracciamento della derivazione, come dimostrato. Ad esempio, in questa analisi rappresentativa, il lignaggio cellulare dell'embrione mutante gsr-1 tracciato è stato confrontato con il lignaggio wild-type di C.elegans. Ed è stato rivelato il rilevamento di un progressivo ritardo nel ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale.
Di conseguenza, gli embrioni mutanti si arrestavano negli stadi intermedi, mentre gli embrioni wild-type progredivano e infine si schiudevano come larve. Inoltre, altre importanti caratteristiche dello sviluppo embrionale, come l'apoptosi, possono essere visualizzate dinamicamente utilizzando la microscopia 4D. Il tracciamento del lignaggio delle immagini DIC deve essere elaborato manualmente.
L'elaborazione di cellule non marcate su luce visibile nelle prime fasi di sviluppo non è accurata per l'analisi degli embrioni. L'applicazione del sistema di riconoscimento delle immagini al campo della microscopia a luce visibile porterà un grande progresso nel campo della biologia dello sviluppo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la preparazione e il montaggio degli embrioni di Caenorhabditis elegans, utilizzando la microscopia 4D per registrare lo sviluppo e tracciare la linea cellulare.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia dello sviluppo
- Tecniche di microscopia
Contesto
- La microscopia 4D consente la ricostruzione delle linee cellulari a livello di singola cellula.
- L'ottica Nomarski può visualizzare i cambiamenti di forma cellulare durante lo sviluppo.
- Questo metodo non richiede animali transgenici o microscopia a fluorescenza.
- Il tracciamento della linea cellulare viene eseguito manualmente, il che può richiedere molto tempo.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un protocollo per la preparazione degli embrioni e la registrazione con microscopia 4D.
- Analizzare il ciclo cellulare, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi in C.elegans.
- Confrontare le linee cellulari mutanti con la linea cellulare di C.elegans di tipo selvatico.
Metodi utilizzati
- Preparazione di piastre di agar per il montaggio degli embrioni.
- Registrazione dello sviluppo embrionale utilizzando un microscopio 4D.
- Tracciamento manuale della linea cellulare utilizzando software specializzato.
- Confronto della linea cellulare tra embrioni mutanti e di tipo selvatico.
Risultati principali
- La ricostruzione della linea cellulare ha rivelato ritardi nel ciclo cellulare degli embrioni mutanti.
- Gli embrioni di tipo selvatico hanno progredito normalmente e si sono schiusi come larve.
- È stata ottenuta una visualizzazione dinamica dell'apoptosi durante lo sviluppo embrionale.
- L'elaborazione manuale del tracciamento della linea cellulare era necessaria per un'analisi accurata.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi dettagliata dello sviluppo embrionale di C.elegans.
- La microscopia 4D è uno strumento potente per lo studio della linea cellulare e dei processi di sviluppo.
- Le possibili applicazioni future potrebbero includere il riconoscimento automatico delle immagini per un'analisi migliorata.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
4D microscopy enables high-resolution, label-free visualization of embryonic development at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking in target validation by revealing dynamic cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis. This approach provides predictive confidence in phenotypic screening by allowing direct observation of developmental phenotypes in a genetically tractable model system, facilitating early identification of compounds or genetic perturbations that disrupt key developmental pathways. The method’s compatibility with standard microscopy and lack of transgenic requirements lower barriers to adoption in discovery workflows focused on developmental toxicity or mechanistic pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking genetic or pharmacological perturbations to specific defects in cell cycle progression, migration, or fate specification.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct, quantitative observation of embryonic phenotypes without reliance on fluorescent reporters or genetic manipulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved datasets on cell lineage and division dynamics suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Facilitates preparation of standardized embryonic mounts for consistent imaging across screening campaigns, enhancing data comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved developmental mechanisms, enabling extrapolation to mammalian systems through comparative lineage analysis.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying embryonic defects that correlate with developmental toxicity or pathway disruption.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, particularly in target validation and phenotypic screening, where direct observation of cellular dynamics informs mechanistic understanding and compound prioritization before lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by visualizing how specific gene knockouts or compound treatments alter embryonic cell lineage progression and tissue morphogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts on cell cycle timing, apoptosis frequency, and mitotic fidelity, supporting assay robustness in phenotypic screens.
- Analytics: Produces spatial-temporal datasets that allow comparison of mutant versus wild-type lineages, enabling statistical evaluation of developmental delays or abnormalities.
- Translational Research: Connects findings in C. elegans to conserved developmental pathways, supporting extrapolation to higher eukaryotes when phenotypic outcomes are mechanistically interpretable.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for developmental phenotyping across multiple projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanism-of-action through direct phenotypic observation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embryo mounting and imaging protocols, minimizing variability in longitudinal studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, observable biomarkers of developmental disruption, reducing investment in false positives.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets or compounds by quantifying developmental phenotypes with single-cell resolution.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy setup, including condenser alignment and Wollaston prism manipulation for optimal DIC contrast.
- Depends on access to a 4D-capable microscope with z-stacking and time-lapse functionality, along with environmental control for temperature-sensitive recording.
- Necessitates standardized operating procedures for embryo extraction, mounting, and sealing to ensure consistency across users and experiments.
- Involves manual lineage tracing, which demands training and practice to maintain accuracy and inter-user reliability.
- Limited by the labor-intensive nature of manual analysis, though mitigated by specialized software for data organization and visualization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
4D Microscope and Slide Preparation
2:28
Embryo Mounting
3:36
4D Microscope 3D Image Acquisition
4:25
4D Movie Analysis
5:28
Cell Lineage Tracing
6:55
Results: Representative C. Elegans Cell Lineage Tracing and Embryonic Development Evaluation
7:58
Conclusion
