Name: Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri un modello di ictus fototrombotico modificato con trombina e rosa bengala per studiare la trombolisi tPA. Questo metodo genera trombi fibrina-plastrine simili a quelli umani, migliorando la ricerca preclinica sulle terapie trombolitiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 a C.Y.K.; e NS106592 a Y.Y.S.).

Questo protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia e segue le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La Figura 1A delinea la sequenza delle procedure chirurgiche di questo protocollo.
1. Impostazione dell'intervento chirurgico
<ol><li>Posizionare un tappetino riscaldante con temperatura impostata a 37 °C sull'adattatore per animali di piccola taglia almeno 15 minuti prima dell'intervento. Preparare un rotolo di clip per il naso per l'adattatore che consenta la rotazione della testa dell'animale. Preparare gli anestetici Ketamina (60 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg).</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra cui forbici, pinze, porta-aghi, emostatici, cotton fioc e suture con autoclave (121 °C a 15 psi per 60 min). Prepara la colla per tessuti e l'unguento per gli occhi. Prepara gli occhiali di protezione laser da 532 nm per i chirurghi. NOTA: Questo protocollo descrive una procedura chirurgica di sopravvivenza maggiore e deve essere condotta utilizzando tecniche asettiche.</li>
	<li>Configurare il sistema di illuminazione con una sorgente laser da 532 nm. Prepara un trapano dentale.</li>
	<li>Preparare la soluzione salina di Rose Bengal (10 mg/mL). Mettere un'aliquota di trombina bovina (0,1 U/μL) sul secchiello del ghiaccio.</li>
	<li>Iniettare Ketoprofene (4,0 mg/kg) per via sottocutanea nel topo come analgesia a 30 minuti prima dell'intervento chirurgico o utilizzare il regime analgesico raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.</li>
</ol>2. Legatura dell'arteria carotide comune omolaterale
<ol><li>Anestetizzare topi maschi C57BL/6NCrl di 10-14 settimane di età compresa tra 22 e 30 g mediante iniezione intramuscolare di ketamina (60 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). NOTA: L'intera procedura chirurgica, che comprende la legatura dell'arteria carotide comune omolaterale attraverso il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale, dovrebbe richiedere ~ 120 minuti. Il regime anestetico sarà in genere efficace per l'intera durata, ma la profondità dell'anestetico deve essere rivalutata almeno ogni 15 minuti. Durante l'apprendimento di queste procedure, potrebbe essere necessario ridosare l'anestesia.</li>
	<li>Eseguire un pizzicotto del piede per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato. Rimuovere i peli sul collo sinistro per la legatura CCA e la testa per il diradamento del cranio con la crema depilatoria.</li>
	<li>Posizionare il mouse sull'adattatore per animali di piccola taglia in posizione supina. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di iodio povidone ed etanolo al 70%.</li>
	<li>Fissare la testa del mouse utilizzando le barre auricolari. Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione cervicale sinistra di 0,5 cm utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta a circa 0,2 cm lateralmente alla linea mediana.</li>
	<li>Utilizzare un paio di pinze seghettate fini per separare i tessuti molli e la fascia per esporre l'arteria carotide comune sinistra (LCCA). Separare con cura il CCA sinistro dal nervo vagale utilizzando un paio di pinze fini e lisce.</li>
	<li>Posizionare una sutura permanente a doppio nodo attorno all'LCCA utilizzando una sutura di seta 5-0 tagliata in segmenti di 20 mm, quindi chiudere la ferita utilizzando clip sterili per ferite.</li>
</ol>3. Assottigliamento del cranio sopra il ramo MCA e fotoattivazione
<ol><li>Capovolgere il mouse in posizione prona sull'adattatore per piccoli animali. Ruotare il rotolo della clip nasale di 15°. Sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di betadine ed etanolo al 70%.</li>
	<li>Praticare un'incisione di 0,8 cm nel cuoio capelluto utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta lungo l'occhio sinistro e l'orecchio per esporre il muscolo temporale, che si trova tra l'occhio e l'orecchio (Figura 1B).</li>
	<li>Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione di 0,5 cm lungo il bordo del muscolo temporale sull'osso parietale sinistro con un paio di pinze seghettate sottili. Eseguire una seconda incisione verticale di 0,3 cm sul muscolo temporale con una microforbice. Ritrarre il muscolo temporale per esporre il bordo dell'osso parietale e dell'osso squamoso. Assicurati di visualizzare il punto di riferimento della sutura coronale tra le ossa frontali e parietali (Figura 1B,C).</li>
	<li>Idratare il cranio applicando soluzione fisiologica sterile per rivelare l'MCA sinistro. Segna il ramo prossimale MCA sull'osso squamoso con un pennarello. Disegnare delicatamente un cerchio di circa 1 mm di diametro che circonda l'area contrassegnata con il trapano dentale pneumatico (impostazione della velocità della fresa al 50% del regolatore di velocità), quindi assottigliare il cranio di circa 0,2 mm di profondità senza toccare la dura sottostante. Interrompere la perforazione fino a quando non rimane uno strato molto sottile di osso.</li>
	<li>Mescolare la soluzione di trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) e Rose bengala (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) in base al peso corporeo del topo. Ad esempio, per un topo di 25 g di peso corporeo, mescolare 20 μL di trombina (0,1 U/μL) e 125 μL di RB (10 mg/mL).</li>
	<li>Iniettare lentamente la soluzione T+RB (145 μL per 25 g di peso corporeo) nel seno retroorbitale con una siringa da insulina (ago #31G). NOTA: Negli esperimenti pilota, il tasso di mortalità di dosi crescenti di trombina mescolate con la dose standard di colorante RB (50 mg/kg) è stato esaminato per la fotoattivazione. La mortalità è stata dello 0% per trombina da 80 U/kg (n=13), del 43% per trombina da 120 U/kg (n=7) e del 100% sia per la trombina da 160 U/kg (n=5) che per quella da 200 U/kg (n=5). Per questo modello è stata quindi scelta una dose di trombina da 80 U/kg. L'imaging a contratto con speckle laser è stato utilizzato anche per escludere la possibilità di coagulazione del sangue dilagante vicino alla cavità orbitale dopo l'iniezione del seno retro-orbitale di T+RB (Figura supplementare 1), nonché la deposizione diffusa di fibrina nell'emisfero controlaterale che non è stata sottoposta a illuminazione laser (Figura supplementare 2).</li>
	<li>Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.</li>
	<li>Applicare l'illuminatore con una luce laser da 532 nm (con energia di 0,5 mW) sul sito perforato a una distanza di 2 pollici per 20 minuti. Visualizzare l'illuminazione sul ramo prossimale dell'MCA attraverso un occhiale di protezione laser (Figura 1C,D). NOTA: L'MCA con illuminazione a 532 nm mostra una fluorescenza rossa sotto la maschera. L'MCA distale scomparirà dopo 10 minuti di illuminazione. Escludere l'animale se il flusso distale di MCA è ancora presente dopo 20 minuti di illuminazione.</li>
	<li>Interrompere l'illuminazione laser dopo 20 min. Chiudere la ferita con clip sterili.</li>
</ol>4. Imaging intravitale (opzionale)
NOTA: Per caratterizzare la formazione di trombi in vivo, utilizzare l'imaging intravirale mediante un confocale spin-disk con sistema di fotoattivazione23.
<ol><li>Crea una finestra cranica di ~ 3 mm di diametro sull'osso parietale del cranio.</li>
	<li>Posizionare un vetro di copertura sulla finestra cranica e posizionare l'MCA distale (~50 μm di diametro) sotto un obiettivo a immersione in acqua 20x.</li>
	<li>Etichettare la piastrina circolante mediante iniezione nella vena caudale dell'anticorpo anti-GPIbβ coniugato DyLight488 (0,1 mg/kg) 5 minuti prima dell'imaging.</li>
	<li>Iniettare la miscela di trombina (80 U/kg) e rosa bengala (50 mg/kg) per via retroorbitale a 5 minuti prima dell'imaging.</li>
	<li>Fotoattivare l'MCA utilizzando un sistema laser a 561 nm con raggio laser di 10 μm di diametro e registrare l'immagine fino alla formazione del trombo.</li>
</ol>5. Somministrazione di tPA
<ol><li>Posizionare l'animale anestetizzato su un tampone caldo a 37 °C. Al punto di tempo di post-fotoattivazione selezionato, bagnare una garza con acqua tiepida a ~45 °C e avvolgerla sulla coda per 1 minuto.</li>
	<li>Iniettare tPA umano ricombinante (10 mg/kg) attraverso la vena caudale con un bolo al 50% e al 50% nell'arco di 30 minuti con pompa per infusione. NOTA: Sebbene la dose clinica di tPA umano ricombinante per il trattamento dell'ictus ischemico acuto sia di 0,9 mg/kg, una dose più elevata (10 mg/kg) è comunemente usata nei roditori per compensare la ridotta reattività del tPA interspecie. Abbiamo anche seguito il protocollo standard di somministrazione di tPA in modelli preclinici di ictus, utilizzando il 50% come bolo e il 50% infuso attraverso la vena caudale per 30 minuti.24</li>
</ol>6. Monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale (CBF)
NOTA: Per confermare il recupero del CBF dopo il trattamento con tPA, utilizzare un sistema di imaging bidimensionale con contrasto a speckle laser15 e registrare immediatamente dopo la fototrombosi (passaggio 3.9) o a 24 ore dopo il trattamento con tPA.
<ol><li>Posizionare l'animale anestetizzato in posizione prona e praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto con il cranio esposto.</li>
	<li>Idratare il cranio con soluzione fisiologica sterile e applicare delicatamente il gel per ultrasuoni sul cranio. Evitare capelli e bolle nel gel, che interferiranno con il segnale CBF.</li>
	<li>Monitorare il CBF in entrambi gli emisferi cerebrali con l'imager a contrasto a speckle laser per 10 minuti.</li>
	<li>Dopo aver registrato l'immagine CBF, chiudere il cuoio capelluto con colla per tessuti e riportare l'animale nella gabbia.</li>
	<li>Analizza il CBF nelle regioni selezionate e calcola la percentuale di recupero del CBF rispetto alla regione controlaterale.</li>
	<li>Quindi, rimetti l'animale in una gabbia calda per il recupero. Monitorare i topi per 5-10 minuti fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Mettere il cibo bagnato nella gabbia e riportarlo alla struttura di cura degli animali. NOTA: Fornire l'analgesia post-operatoria come raccomandato dalle linee guida istituzionali locali.</li>
</ol>7. Misurazione del volume dell'infarto mediante colorazione con cloruro di trifenile tetrazolio (TTC)
<ol><li>Ventiquattro ore dopo la fototrombosi, anestetizzare profondamente l'animale secondo le linee guida istituzionali locali per la chirurgia di non sopravvivenza. NOTA: Somministriamo tribromoetanolo (avertina) 250 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale (IP).</li>
	<li>Eseguire la perfusione transcardica con PBS, raccogliere il cervello fresco e incorporare in gel di agar al 3%.</li>
	<li>Sezionare la fetta di cervello con uno spessore di 1 mm mediante vibratomo e incubare in una soluzione di TTC al 2% per 10 minuti.</li>
	<li>Quantificare il volume totale dell'infarto da 6 fette cerebrali come volume assoluto con il software ImageJ. NOTA: L'edema cerebrale non è stato utilizzato come misurazione dell'esito per due motivi. In primo luogo, la colorazione TTC misura la vitalità tissutale (attraverso l'attività di riduzione mitocondriale) che è una conseguenza più grave dell'edema. In secondo luogo, man mano che l'infarto procede, si verificano sia edema vasogenico che citotossico e non possono essere facilmente distinti dai metodi standard di misurazione dell'edema cerebrale. Tuttavia, abbiamo utilizzato la marcatura anti-immunoglobina (IgG) per valutare l'integrità della barriera emato-encefalica (BBB) e abbiamo trovato uno stravaso di IgG comparabile a 6 ore dopo la fotoattivazione in entrambi i modelli di ictus RB e T+RB (Figura 3 supplementare).</li>
</ol>8. Misurazione della formazione del trombo
NOTA: Per misurare la formazione di trombi, prelevare il cervello a 1 ora e 2 ore dopo la fototrombosi per la misurazione del trombo nell'MCA mediante immunochimica (IHC) e per la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot, rispettivamente.
<ol><li>Eseguire l'IHC per la caratterizzazione della composizione del coagulo. Fissare il cervello con il 4% di paraformaldeide durante la notte e poi disidratare il cervello con il 30% di saccarosio per l'inclusione dell'OCT.</li>
	<li>Sezionare il cervello con orientamento sagittale in 20 μm di spessore, ed eseguire l'IHC con anticorpi specifici contro fibrinogeno, piastrine (glicoproteina IIb), globuli rossi (TER119) e vasi sanguigni (isolectina GS-IB4).</li>
	<li>Eseguire la misurazione della fibrina nell'emisfero cerebrale mediante immunoblot con un anticorpo contro il fibrinogeno.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'ictus fototrombotico RB tradizionale, introdotto nel 1985, è un modello interessante di ischemia cerebrale focale per semplici procedure chirurgiche, bassa mortalità e alta riproducibilità dell'infarto cerebrale. 5 In questo modello, il colorante fotodinamico RB attiva rapidamente le piastrine all'eccitazione della luce, portando a densi aggregati che occludono il vaso sanguigno 5,8,23. Tuttavia, la pic...

La trombectomia endovascolare e la trombolisi mediata da tPA sono le uniche due terapie approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per l'ictus ischemico acuto, che affligge ~700.000 pazienti all'annonegli Stati Uniti. Poiché l'applicazione della trombectomia è limitata all'occlusione dei grandi vasi (LVO), mentre la trombolisi tPA può alleviare le occlusioni dei piccoli vasi, entrambe sono terapie preziose per l'ictus ischemico acuto2. Inoltre, la combinazione di entrambe le terapie (ad esempio, l'inizio della trombolisi tPA entro 4,5 ore dall'insorgenza dell'ictus, seguita da trombectomia) migliora la riperfusione e gli esiti funzionali3. Pertanto, l'ottimizzazione della trombolisi rimane un obiettivo importante per la ricerca sull'ictus, anche nell'era della trombectomia.
I modelli tromboembolici sono uno strumento essenziale per la ricerca preclinica sull'ictus che mira a migliorare le terapie trombolitiche. Ciò è dovuto al fatto che i modelli di occlusione vascolare meccanica (ad esempio, l'occlusione MCA della sutura intraluminale) non producono coaguli di sangue e il suo rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione dell'occlusione meccanica è eccessivamente idealizzato 4,5. Ad oggi, i principali modelli tromboembolici includono la fototrombosi 6,7,8, l'applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl3)9, la microiniezione di trombina nel ramo MCA 10,11, l'iniezione di (micro)emboli ex vivo nell'MCA o nell'arteria carotide comune (CCA)12,13,14 e l'ipossia-ischemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Questi modelli di ictus differiscono nella composizione istologica dei coaguli che ne derivano e nella sensibilità alle terapie litiche mediate da tPA (Tabella 1). Variano anche nella necessità chirurgica di craniotomia (necessaria per l'iniezione di trombina in situ e l'applicazione topica di FeCl3), nella consistenza delle dimensioni e della posizione dell'infarto (ad esempio, l'infusione di microemboli da parte di CCA produce risultati molto variabili) e negli effetti globali sul sistema cardiovascolare (ad esempio, il tHI aumenta la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca per compensare la vasodilatazione periferica indotta dall'ipossia).
Il modello di ictus fototrombotico (PTS) basato su coloranti RB ha molte caratteristiche interessanti, tra cui semplici procedure chirurgiche senza craniotomia, bassa mortalità (in genere < 5%) e dimensioni e posizione prevedibili dell'infarto (nel territorio di fornitura di MCA), ma presenta due principali limitazioni. 8 Il primo avvertimento è la risposta debole a nulla al trattamento trombolitico mediato da tPA, che è anche uno svantaggio del modelloFeCl 3 7,19,20. Il secondo avvertimento dei modelli di ictus PTS e FeCl3 è che i trombi che ne derivano sono costituiti da aggregati piastrinici densamente impacchettati con una piccola quantità di fibrina, che non solo portano alla sua resilienza alla terapia tPA-litica, ma si discostano anche dal modello di trombi piastrinici:fibrina misti nei pazienti con ictus ischemico acuto21,22. Al contrario, il modello di microiniezione di trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizzata e un contenuto incerto di piastrine10.
Dato il ragionamento di cui sopra, abbiamo ipotizzato che la miscela di RB e una dose sub-trombotica di trombina per la fotoattivazione mirata a MCA attraverso il cranio assottigliato possa aumentare la componente di fibrina nei trombi risultanti e aumentare la sensibilità al trattamento litico mediato da tPA. Abbiamo confermato questa ipotesi,23 e qui descriviamo in dettaglio le procedure del modello di ictus fototrombotico modificato (T+RB).

<table><tbody><tr><td>2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>infarto</td></tr><tr><td>4-0 Sutura monofilamento di nylon</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>forniture chirurgiche</td></tr><tr><td>5-0 sutura di seta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>624143</td><td>forniture chirurgiche</td></tr><tr><td>Raggio laser 543nm</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>fototrombosi</td></tr><tr><td>topi maschi adulti</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14 settimane (22~30 g)</td></tr><tr><td>Barra per anestesia per</td><td>l'officina meccanica</td> dell'adattatore del mouse, <td>configurazione chirurgica</td>UVA <td></td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-tribromoetanolo)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>eutanasia</td></tr><tr><td>Trapano odontoiatrico</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>configurazione chirurgica</td></tr><tr><td>Microscopio digitale</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>imaging cerebrale</td></tr><tr><td>Dissezione microscopio</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>configurazione chirurgica</td></tr><tr><td>Pinze curve fini (seghettate)</td><td>Strumento chirurgico</td> <td>FST</td><td>11370-31</td></tr><tr><td>Pinze curve fini (lisce)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>strumento chirurgico</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Emostatici Halsted-Mosquito</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Pompa di calore con cuscinetto riscaldante</td> Pompa <td>di</td>infusione <td>chirurgica Gaymar</td><td>TP700</td></tr><tr><td></td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>trattamento trombolitico</td></tr><tr><td>Siringa da insulina con ago da 31G</td><td>BD</td><td>328291</td><td>fototrombosi</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>CCM,</td><td>anestesia UVA</td><td></td></tr><tr><td>Laser protettivo google 532nm</td><td>Fototrombosi</td><td></td><td></td></tr> <tr>Thorlabs LG3<td>Ketoprofene</td><td>CCM, UVA</td><td></td>, <td>NSAID, analgesia</td>,</tr><tr><td>micro portaaghi</td><td>FST</td><td>12060-01</td>, strumento <td>chirurgico</td>FST</tr><tr><td></td><td>15000-03</td>, <td>strumento chirurgico</td><td></td></tr><tr><td>MoorFLPI-2, imager del flusso sanguigno</td><td>Moor</td>, <td>sorgente laser da 780 nm</td>, Laser <td>Speckle Contrast Imaging</td></tr><tr><td>, adattatore per mouse</td><td>RWD</td><td>68014</td><td></td></tr><tr><td>Unguento Puralube Vet</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>prevenzione della secchezza oculare Punte</td></tr> per <tr><td>divaricatori</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>configurazione chirurgica</td></tr><tr><td>Fototrombosi Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>Fototrombosi</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Colla tissutale</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>forniture chirurgiche</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo activase 2mg</td><td>trattamento trombolitico</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>xilazina</td><td>CCM, anestesia UVA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tpa

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Un modello ideale di ictus tromboembolico richiede determinate proprietà, tra cui procedure chirurgiche relativamente semplici con bassa mortalità, dimensioni e posizione dell'infarto coerenti, precipitazione di coaguli di sangue misto piastrino-fibrina simili a quelli dei pazienti e un'adeguata sensibilità al trattamento fibrinolitico. Il modello di ictus fototrombotico a base di colorante rosa bengala (RB) soddisfa i primi due requisiti, ma è altamente refrattario al trattamento litico mediato da tPA, presumibilmente a causa della sua composizione del coagulo ricca di piastrine, ma povera di fibrina. Ragioniamo che la combinazione di colorante RB (50 mg/kg) e una dose sub-trombotica di trombina (80 U/kg) per la fotoattivazione mirata al ramo prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA) può produrre coaguli arricchiti di fibrina e sensibili al tPA. Infatti, il modello di fototrombosi combinato con trombina e RB (T+RB) ha innescato coaguli di sangue misti piastrina:fibrina, come dimostrato dall'immunocolorazione e dagli immunoblots, e ha mantenuto dimensioni e posizioni dell'infarto coerenti, oltre a una bassa mortalità. Inoltre, l'iniezione endovenosa di tPA (Alteplase, 10 mg/kg) entro 2 ore dalla fotoattivazione ha ridotto significativamente le dimensioni dell'infarto nella fototrombosi T+RB. Pertanto, il modello di ictus fototrombotico potenziato dalla trombina può essere un utile modello sperimentale per testare nuove terapie trombolitiche.

In primo luogo, abbiamo confrontato il contenuto di fibrina in RB rispetto ai coaguli di sangue indotti dalla fototrombosi T+RB. I topi sono stati sacrificati mediante perfusione transcardica di fissativi a 2 ore dopo la fotoattivazione e i cervelli sono stati rimossi per la colorazione a immunofluorescenza del ramo MCA nei piani longitudinali e trasversali. Nella fototrombosi RB, il ramo MCA era densamente impacchettato con piastrine CD41+ e poca fibrina (Figura 2A,C</str...

I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un'elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Vogliamo creare un modello di ictus che produca coaguli di sangue simili ai campioni dei pazienti e risponda alla terapia trombolitica clinicamente rilevante. Pertanto, modifichiamo il classico modello di ictus fototrombotico e mescoliamo la trombina e il colorante fotodinamico rosa bengala prima della fotoattivazione. Siamo lieti che questa procedura crei effettivamente coaguli di sangue altamente sensibili alla trombolisi mediata da tPA.Questo modello di ictus fototrombotico modificato, che utilizza procedure chirurgiche molto semplici con un basso tasso di mortalità, ha prodotto dimensioni e posizione dell'infarto altamente coerenti. Si produce anche un coagulo di sangue misto di fibrina e piastrine che sono simili a quelli del paziente con ictus acuto. Pertanto, pensiamo che sia molto utile per la ricerca preclinica sull'ictus sviluppare terapie trombolitiche più efficaci.Speriamo che più persone utilizzino il nostro modello. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Yu-Yo Sun, il nostro assistente professore di ricerca nel nostro gruppo. 30 minuti prima dell'intervento, preparare il topo iniettando un analgesico.Dopo aver anestetizzato il topo, eseguire un pizzicotto del dito del piede per assicurarsi che sia completamente anestetizzato. Quindi rimuovere i peli sul collo sinistro e sulla testa con una crema depilatoria. Posizionare il mouse sull'adattatore per animali di piccola taglia in posizione supina e sterilizzare l'area cutanea chirurgica pulendola con tre passaggi alternati di iodio povidone ed etanolo al 70%.Sotto un microscopio da dissezione, praticare un'incisione cervicale sinistra di 0,5 centimetri utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta a circa 0,2 centimetri lateralmente alla linea mediana. Successivamente, utilizzando un paio di pinze seghettate fini, separare i tessuti molli e la fascia per esporre l'LCCA. Quindi, utilizzando un paio di pinze fini e lisce, separare con cura l'LCCA dal nervo vagale.Posizionare una sutura permanente a doppio nodo attorno all'LCCA utilizzando una sutura di seta 5-0. Capovolgi il mouse in posizione prona e ruota il rotolo della clip del naso di 15 gradi. Quindi sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di Betadine ed etanolo al 70%.Fai un'incisione di 0,8 centimetri nel cuoio capelluto usando un paio di micro forbici e una pinza dritta lungo l'occhio sinistro e l'orecchio per esporre il muscolo temporale. Successivamente, praticare un'incisione di 0,5 centimetri lungo il bordo del muscolo temporale sull'osso parietale sinistro. Quindi eseguire una seconda incisione verticale di 0,3 centimetri sul muscolo temporale e ritrarre il muscolo per esporre il bordo dell'osso parietale e dell'osso squamoso.Assicurati di visualizzare il punto di riferimento della sutura coronale tra le ossa frontali e parietali. Successivamente, inumidisci il cranio applicando soluzione fisiologica sterile per rivelare l'MCA sinistro e segna il ramo prossimale dell'MCA sull'osso squamoso con un pennarello. Disegna delicatamente un cerchio di un millimetro di diametro che circonda quest'area contrassegnata con un trapano dentale pneumatico.Quindi assottigliare il cranio a circa 0,2 millimetri di profondità senza toccare la dura sottostante. Interrompere la perforazione quando rimane uno strato molto sottile di osso. Successivamente, mescolare la soluzione di trombina e rosa bengala in base al peso corporeo del topo e iniettare lentamente la miscela nel seno retroorbitale con un ago calibro 31.Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Applicare l'illuminatore con una luce laser a 532 nanometri sul sito perforato entro una distanza di due pollici per 20 minuti. Visualizza l'illuminazione sul ramo prossimale dell'MCA attraverso occhiali a proiezione laser.Dopo 20 minuti, interrompere l'illuminazione laser. Fai una finestra cranica di tre millimetri di diametro sull'osso parietale del cranio e posiziona un vetro di copertura su di essa. Quindi posizionare l'MCA distale sotto una lente dell'obiettivo a immersione in acqua 20x.Etichettare la piastrina circolante mediante iniezione nella vena caudale dell'anticorpo coniugato anti-GP1b-beta DyLight 488 cinque minuti prima dell'imaging. Quindi iniettare retroorbitalmente la miscela di soluzione di trombina e rosa bengala. Fotoattivare l'MCA utilizzando un sistema laser a 532 nanometri con un raggio laser di 10 micrometri di diametro e registrare l'immagine fino alla formazione di trombi.Per la somministrazione di tPA, posizionare l'animale anestetizzato su un tampone caldo a 37 gradi Celsius. Avvolgere la coda con una garza bagnata calda a 45 gradi Celsius per un minuto nel punto di tempo post-fotoattivazione selezionato. Successivamente, iniettare il tPA umano ricombinante attraverso la vena caudale.Iniettare il 50% in bolo e infondere il restante 50% per 30 minuti utilizzando una pompa per infusione. Per monitorare il flusso sanguigno cerebrale, praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto con il cranio esposto. Idratare il cranio con soluzione fisiologica sterile e applicare delicatamente il gel per ultrasuoni su di esso, assicurandosi di evitare capelli o bolle d'aria nel gel.Monitorare il flusso sanguigno cerebrale in entrambi gli emisferi cerebrali con l'imager a contrasto laser speckle per 10 minuti. La marcatura a immunofluorescenza mostra che nella fototrombosi basata sul colorante del Bengala rosa, il ramo MCA era densamente imballato con piastrine CD41-positive e poca fibrina. Al contrario, nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il ramo MCA è stato occluso da coaguli di piastrine e fibrina mescolati in modo casuale.L'analisi di immunoblotting ha mostrato un aumento più che doppio della deposizione di fibrina nell'emisfero omolaterale nella fototrombosi del bengala rosa più rosa rispetto al solo bengala rosa. L'imaging intravitale basato su microscopio confocale ha mostrato che un'iniezione endovenosa di trombina non è riuscita a indurre aggregati piastrinici, anche sotto l'illuminazione laser. Le piastrine formavano coaguli omogenei nel modello di fototrombosi del Bengala rosa, ma aggregati irregolari con più regioni deboli nel modello di trombina più bengala rosa.Il CBF dello stesso topo prima e 24 ore dopo il trattamento con tPA rispetto al veicolo è stato misurato mediante imaging con contrasto laser speckle e normalizzato all'emisfero controlaterale. Nella fototrombosi del Bengala rosa, il trattamento con tPA ha portato a una tendenza al recupero del CBF, in particolare nell'area di confine ischemica rispetto ai topi trattati con veicolo. Nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il recupero del CBF nei topi trattati con tPA era più prominente e i rami prossimali di MCA diventavano spesso visibili a 24 ore.Nella fototrombosi del Bengala rosa, una dimensione dell'infarto simile è stata rilevata nei topi trattati con veicolo e trattati con tPA. Al contrario, nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il trattamento litico tPA ha ridotto significativamente l'infarto a 0,5, una o due ore, ma non a sei ore dopo la fotoattivazione rispetto ai topi trattati con veicolo, la generazione di fibrina mediata da trombina è cruciale per la formazione di trombi in questa procedura. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la composizione del coagulo e per studiare ulteriormente i trattamenti trombolitici.A seguito di questa procedura, è possibile applicare altri metodi di terapia trombolitica e determinare l'efficacia successiva. L'aggiunta di trombina consente di regolare la composizione del coagulo da povera di fibrina a ricca di fibrina, consentendo ai ricercatori di sviluppare strategie terapeutiche clinicamente rilevanti.

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Questo video dimostra la procedura per generare ictus fototrombotico in un modello murino mediante illuminazione laser di un cranio intatto dopo la somministrazione di colorante fotosensibile.

Modellazione dell'ictus fototrombotico in un modello murino: una tecnica di illuminazione laser attraverso il cranio del topo dopo la somministrazione di colorante fotosensibile per indurre la fototrombosi

Photothrombosis è una tecnica rapida, mini-invasiva per indurre le piccole e ben delimitate del miocardio in aree di interesse in modo altamente riproducibile. È particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.

Ischemia Photothrombotic: un modello fotochimico lesione corticale minimamente invasiva e riproducibile per mouse Studi Stroke

Qui, descriviamo un approccio di microscopia ottica semi-invasiva per l'induzione di un coagulo fototrombotico di Rose Bengal nella corteccia somatosensoriale di un topo in vivo.  Vengono descritti gli aspetti tecnici della procedura di imaging, dall'induzione di un evento fototrombotico all'applicazione e alla raccolta dei dati.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

I modelli di ictus tromboembolico sono strumenti vitali per ottimizzare la terapia di ricanalizzazione. Qui riportiamo un modello murino di ictus trombotico basato sull'insulto ipossico-ischemico cerebrale transitorio (tHI), che innesca trombosi e infarto e risponde favorevolmente alla fibrinolisi mediata dall'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) in una finestra terapeutica simile a quelle dei pazienti con ictus.

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

La fototrombosi è una procedura minimamente invasiva e altamente riproducibile per indurre ischemia focale nel midollo spinale e funge da modello di lesione del midollo spinale nei topi.

Photothrombosis-indotta ischemia focale come un modello di lesioni del midollo spinale nei topi

Riportiamo una procedura raffinata del cloruro ferrico (FeCl 3) modelli trombosi -indotta sulla carotide e dell'arteria mesenterica così come la vena, caratterizzato in modo efficiente usando la microscopia intravitale per monitorare il tempo di occlusiva la formazione di trombi.

Ferrico I modelli murini Trombosi indotta da cloruri

Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l'occlusione microvascolare permanente utilizzando l'illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Utilizzando un approccio completamente ottico, l'ictus ischemico viene indotto registrando contemporaneamente l'attività neuronale del Ca2+ utilizzando un biosensore fluorescente nel nucleo emergente dell'ictus di un topo sveglio e in comportamento.

Fototrombosi simultanea e fotometria delle fibre per indurre e monitorare l'ictus ischemico nei topi comportanti

Per simulare l'ictus tromboembolico, sono stati iniettati emboli preparati con sangue di ratto eterologo nell'arteria cerebrale media, seguiti dalla somministrazione di trombolisi sistemica per la ricanalizzazione. Questa versione del modello è ottimizzata per l'uso in una rete multi-laboratorio e supporta il test di più candidati terapeutici.

La Rete di Valutazione Preclinica dell'Ictus Modello Multilaboratorio dell'Ictus Tromboembolico con Trombolisi: TE-MCAo

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Scopri un modello di ictus fototrombotico modificato con trombina e rosa bengala per studiare la trombolisi tPA. Questo metodo genera trombi fibrina-plastrine simili a quelli umani, migliorando la ricerca preclinica sulle terapie trombolitiche.

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

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