Name: Visualizzazione dellinnervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Scopri la visualizzazione 3D delle fibre nervose CGRP e dei vasi sanguigni nella dura madre cranica del topo usando immunofluorescenza e tracciamento neurale retrogrado. Questo metodo avanzato permette di studiare le interazioni neurovascolari.

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Questo studio è stato supportato dal progetto del National Key R&D Program of China (Project Code n. 2019YFC1709103; n. 2018YFC1707804) e National Natural Science Foundation of China (Project Code n. 81774211; n. 81774432; n. 81801561).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-09-29-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati dodici ratti maschi adulti Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Gli animali [numero di licenza SCXK (JING) 2017-0005] sono stati forniti dai National Institutes for Food and Drug Control.
1. Innervazione del dura mater cranale di ratto
<ol><li>
Perfusioni
	<ol>
<li>Iniettare per via intraperitoneale un sovradosaggio di soluzione di tribromoetanolo (250 mg/kg) al ratto per indurre l'eutanasia.</li>
		<li>Una volta che il respiro si ferma, per infusione transcardiale con 100 mL dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250-300 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).</li>
		<li>Dopo la perfusione, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Quindi sezionare la dura mater cranale lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo nel modello a montaggio intero (Figura 1). Eseguire la post-fissazione in paraformaldeide al 4% per 2 ore, quindi crioproteggere in saccarosio al 25% in 0,1 M PB per più di 24 ore a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunoistochimica a fluorescenza per l'etichettatura CGRP e phalloidin NOTA: Una combinazione di colorazione fluorescente di CGRP e phalloidin è stata applicata per rivelare la correlazione spaziale delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nel dura mater cranico del ratto nel modello a montaggio intero.<ol>
<li>Risciacquare il dura mater craniciale in 0,1 M PB per circa 1 minuto.</li>
		<li>Incubare il dura mater in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB per 30 min.</li>
		<li>Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C11.</li>
		<li>Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.</li>
		<li>Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 dell'asino (1:500) e phalloidin 568 (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente (26 °C).</li>
		<li>Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB.</li>
		<li>Tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Indossare coverlips con 50% glicerina prima dell'osservazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osservazione e registrazione
	<ol>
<li>Osservare i campioni fluorescenti al microscopio fluorescente o a un sistema di imaging confocale.</li>
		<li>Scatta le immagini dell'intera dura mater montata da un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale (4x, NA: 0.13) e usa un tempo di esposizione di 500 ms. I mosaici di immagini della dura mater sono stati completati con un software di microscopio fluorescente (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con phalloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione erano di 488 nm (verde) e 594 nm (rosso). Il foro a spillo confocale è 110 (20x) e 105 μm (40x). La risoluzione dell'acquisizione dell'immagine è di 640 x 640 pixel.</li>
		<li>Cattura 20 immagini in fotogrammi da 2 μm da ogni sezione spessa 40 μm ed esegui un'integrazione di immagini singole a fuoco con un sistema software associato all'elaborazione delle immagini confocali per l'analisi 3D come segue: Set Start Focal Plane | Impostare il piano focale finale | Impostare le dimensioni dei | Selezionate Serie profondità (Depth Pattern| Acquisizione immagini | Serie Z.
</li>
		<li>Usa un software di fotoritocco per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini per ottimizzare la visualizzazione. Prestare attenzione a non rimuovere alcun dato dalle immagini.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Studio di tracciamento retrogrado con FG
<ol><li>Procedure chirurgiche
	<ol>
<li>Determinare l'area di coordinate di interesse nella dura mater cranicia del ratto.</li>
		<li>Preparare una micro siringa da 10 μL e testarla con paraffina liquida.</li>
		<li>Anestetizzare i ratti con soluzione di tribromoetanolo (150 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Verificare la profondità in anestesia per la mancanza di risposta al dito del dito del piedi.</li>
		<li>Radere la testa al topo con un rasoio elettrico.</li>
		<li>Mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Quindi mettere il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.</li>
		<li>Pulire il sito chirurgico della pelle della testa usando il 10% di iodio di povidone seguito dal 75% di etanolo.</li>
		<li>Fai un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto.</li>
		<li>Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone (Figura 1A).</li>
		<li>Praticare un piccolo foro (~5-7 mm) utilizzando un trapano a bava con una punta rotonda (#106) sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'MMA12e assicurarsi che il dura mater cranici sia stato mantenuto intatto(Figura 1B).</li>
		<li>Costruire una banca intorno al foro con cemento silicato dentale per limitare la diffusione del tracciante(Figura 1C).</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di 2% FG nel foro intorno a MMA con una microsiringa da 10 μL (Figura 1D).</li>
		<li>Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica.</li>
		<li>Mettere un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigillare i bordi con cera ossea per evitare perdite di tracciante ed evitare di contaminare i tessuti circostanti.</li>
		<li>Suturare la ferita con filo sterile.</li>
		<li>Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi.</li>
		<li>Riportare i ratti nelle loro gabbie e aggiungere un antibiotico e un analgesico nell'acqua potabile.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusioni e sezioni
	<ol>
<li>Dopo 7 giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti come accennato in precedenza nelle procedure di cui al punto 1.1.</li>
		<li>Sezionare i DDG TG e C1-4, quindi post-fissarli e crioproteggerli come sopra menzionato nella sezione 1.1.3 (Figura 1F).</li>
		<li>Tagliare i TG e i DRG allo spessore di 30 μm su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale e montati su vetri rivestiti di silani.</li>
	</ol></li>
	<li>Doppia immunofluorescenza per l'etichettatura FG e CGRP nei TG e nei DRG NOTA: Sebbene l'etichettatura FG possa essere osservata direttamente con l'illuminazione UV sotto lampada al mercurio senza colorazioneaggiuntiva 13,14,15,16, i neuroni etichettati con FG sono stati ulteriormente esaminati nei TG e nelle DRAG cervicali utilizzando doppie immunofluorescenze con FG e CGRP per rivelare le origini delle fibre nervose duralI CGRP-immunoreattive nei TG e nei DRG.<ol>
<li>Cerchia le sezioni con la penna istochimica.</li>
		<li>Incubare le sezioni per 30 min in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB.</li>
		<li>Trasferire i campioni nella soluzione di antifluorogoldo di coniglio (1:1000) e anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C.</li>
		<li>Lavare le sezioni tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.</li>
		<li>Incubare in una soluzione mista di anticorpo secondario alexa fluor 594 (1:500) e anti-topo d'asino Alexa Fluor 488 (1:500) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare e applicare le coperture alle sezioni come procedure nei passaggi 1.2.6 e 1.2.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Osservazione e registrazione
	<ol>
<li>Scatta immagini dei neuroni etichettati FG in TG e DRG sotto illuminazione UV tramite microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.</li>
		<li>Cattura le immagini dei neuroni etichettati FG e CGRP in TG e DRG sotto un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.</li>
		<li>Utilizzare il software di modifica per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e aggiungere etichette nelle immagini.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+Head+and+Neck%2C+Dura+Mater%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo dimostrato con successo la distribuzione e l'origine delle fibre nervose cgrp-immunoreattive nel dura mater cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione 3D e gli approcci di tracciamento neurale con anticorpo CGRP e tracciante neurale FG, fornendo le evidenze istologiche e chimiche per comprendere meglio la rete neurovascolare udirica.
Come era noto, il CGRP svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'emicrania4,...

Il dura mater cranico è lo strato più esterno di meningi per proteggere il cervello e contiene abbondanti vasi sanguigni e diversi tipi di fibre nervose1,2. Molti studi hanno dimostrato che la dura mater cranici sensibilizzata può essere il fattore chiave che porta al verificarsi di mal di testa, che coinvolge la vasodilatazione e l'innervazioneanomale 3,4,5. Pertanto, la conoscenza della struttura neurovascolare nella dura madre cranale è importante per comprendere la patogenesi del mal di testa, specialmente per l'emicrania.
Sebbene l'innervazione dura sia stata precedentemente studiata con l'immunoistochimica convenzionale, la correlazione spaziale delle fibre nervose e dei vasi sanguigni nella dura madre cranico è statameno studiata 6,7,8,9. Al fine di rivelare la struttura neurovascolare durale in modo più dettagliato, peptide correlato al gene calcitonina (CGRP) e phalloidin sono stati selezionati come marcatori per la colorazione rispettivamente delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nella dura madre cranale a montaggio intero con immunofluorescenza e istochimica fluorescente10. Può essere una scelta ottimale ottenere una visione tridimensionale (3D) della struttura neurovascolare. Inoltre, il fluorogold (FG) è stato applicato sull'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nel dura mater cranico per determinare l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP, e rintracciato al ganglio trigemino (TG) e ai gangli della radice dorsale cervicale (C), mentre i neuroni etichettati FG sono stati ulteriormente esaminati insieme alla CGRP usando l'immunofluorescenza.
Lo scopo di questo studio era quello di fornire uno strumento efficace per studiare la struttura neurovascolare nella dura mater cranale per l'innervazione immunoreattiva CGRP e la sua origine. Sfruttando il dura mater trasparente a montaggio intero e combinando l'immunofluorescenza, il tracciamento retrogrado, le tecniche confocali e la ricostruzione 3D, ci aspettavamo di presentare una nuova visione 3D della struttura neurovascolare nella dura mater cranale. Questi approcci metodologici possono essere ulteriormente serviti per esplorare la patogenesi di diversi mal di testa.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen di Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>Protegge dalla luce; RRID: AB_141607</td></tr><tr><td>Strumento per stereotassi cerebrale</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>Versione 1.1</td><td>Software del microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Sistema di imaging confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold (FG)</td><td>Fluorochrome</td><td>52-9400</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Sistema di imaging fluorescente</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo di congelamento</td><td>Thermo</td><td>Microm International&nbsp; GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td><td>Olympus</td><td>Versione 4.2</td> Sistema <td>software di elaborazione delle immagini confocali</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-CGRP</td><td>Abcam</td><td>ab81887</td><td>RRID: AB_1658411</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina 568</td><td>Molecolare& nbsp; Sonde</td><td>A12380</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Photoshop e&nbsp; Illustrazione</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td>Software di fotoritocco</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Fluorogold</td><td>Abcam</td><td>ab153</td><td>RRID: AB_90738</td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>National Institutes for Food and Drug Control</td><td>SCXK (JING) 2014-0013</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus vetrini per microscopio</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr></tbody></table>

visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo cranial dura mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Lo scopo di questo studio era quello di esaminare la distribuzione e l'origine delle fibre nervose sensoriali immunoreattive del peptide (CGRP) immunoreattive del basamento cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la tecnica di tracciamento retrogrado. Qui, le fibre nervose e i vasi sanguigni sono stati macchiati usando rispettivamente immunofluorescenza e tecniche istochimiche con CGRP e falloidina fluorescente. La correlazione spaziale delle fibre nervose durali CGRP-immuoreattive e dei vasi sanguigni è stata dimostrata dalla ricostruzione 3D. Nel frattempo, l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP sono state rilevate con la tecnica di tracciamento neurale con fluorogold (FG) dall'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nella dura mater cranica al ganglio trigeminale (TG) e gangli della radice dorsale cervicale (C). Inoltre, sono state esaminate anche le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG nei TG e nei DRG insieme al CGRP utilizzando doppie immunofluorescenze. Sfruttando il campione trasparente a montaggio intero e la ricostruzione 3D, è stato dimostrato che le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole etichettate con phalloidina corrono insieme o formano separatamente una rete neurovascolare uditivo in una vista 3D, mentre i neuroni etichettati FG sono stati trovati nei rami oftalmico, mascellare e mandibolare del TG, così come nei DRG C2-3 ipsilateral sul lato dell'applicazione del tracciante in cui alcuni dei neuroni etichettati FG presentavano espressione immunoreattiva CGRP. Con questi approcci, abbiamo dimostrato le caratteristiche distributivi delle fibre nervose immunoreattive CGRP intorno ai vasi sanguigni nella dura madre cranico, così come l'origine di queste fibre nervose da TG e DRG. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranicio sotto la condizione fisiologica o patologica.

Struttura neurovascolare del dura mater craniciale Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali e i tessuti connettivi etichettati con falloidina sono stati chiaramente dimostrati in tutta la dura madre cranica a montaggio intero in un modello 3D(Figura 2C,D, E, F). È stato dimostrato che sia le fibre nervose immunoreatt...

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l'origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.

Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Questo protocollo può fornire un riferimento metodologico variabile per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranici sulla condizione fisiologica o patologica. Sfruttando la dura mater trasparente a montaggio intero, la correlazione spettrale delle fibre nervose immunoreattive CGRP durali e dei vasi sanguigni può essere dimostrata in una vista 3D. Dopo aver eutanasiato un ratto, lo ha perfuso trascardialmente con 100 millilitri dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250 a 300 millilitri di paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1.Al termine, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Sezionare il dura mater cranici lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo in un intero modello di montaggio. Risciacquare il dura mater craniciale in tampone di fosfato molare 0,1 per circa un minuto e incubarlo in una soluzione di blocco.Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo durante la notte. Il giorno seguente, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0,1. Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 e phalloidin 568 in 0,1.Tampone fosfato molare contenente l'1% di siero normale di asino e lo 0,5%Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0.1, tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio. Mettere in coperchio scivola con il 50% di glicerina prima dell'osservazione.Immagini l'intero supporto dura mater con un microscopio fluorescente, quindi scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con falloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Radere la testa del topo con un rasoio elettrico, quindi mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Posizionare il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.Pulire il lato chirurgico della pelle della testa utilizzando il 75% di etanolo e fare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Praticare un piccolo foro usando un trapano a bava con una punta rotonda sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'arteria meningea centrale.Costruisci una banca intorno al foro con cemento silicato dentale e aggiungi due microlitri di fluorogold nel foro intorno all'arteria meningea centrale con un microsiringe da 10 microlitri. Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica. Metti un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigilla i bordi con cera ossea.Suturare la ferita con filo sterile. Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi. Quindi riporta i topi nelle loro gabbie.Dopo sette giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti con soluzione salina normale dello 0,9%, seguita da paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1. Sezionare il TG e la cervicale da uno a quattro DDG, quindi tagliarli allo spessore di 30 micrometri su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale. E montare le sezioni su vetri rivestiti di silane.Cerchiare le sezioni con una penna istochimica e incubarle per 30 minuti in soluzione di blocco. Trasferire i campioni nella soluzione di anticorpi anti-fluorogoldi e topi anti-CGRP del coniglio e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte in tampone di fosfato molare 0,1.Incubare le sezioni lavate in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 594 e anti-topo di asino Alexa Fluor 488. Quindi lavarli tre volte in tampone di fosfato molare 0,1 e applicare scivolamenti di copertura con 50% glicerina per l'osservazione. Scatta immagini dei neuroni etichettati fluorogold in TG e DRG sotto illuminazione UV usando un microscopio fluorescente.Quindi, cattura le immagini dei neuroni etichettati fluorogold e CGRP nei TG e nei DRG. Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali etichettate con phalloidin e i tessuti connettivi sono stati chiaramente visualizzati in tutto il montante dura mater cranico in un modello 3D. Sia le fibre nervose immunoreattive CGRP spesse che sottili corrono in parallelo alle arterie uditive intorno alla parete vascolare o tra i vasi sanguigni.Sette giorni dopo l'applicazione del fluorogoldo sulla regione dell'arteria meningea media e della dura madre cranica del ratto, i neuroni etichettati fluorogold sono stati rilevati nei TG e nelle DRAG cervicali sul lato ipsilaterale dell'applicazione del tracciante, che è stato osservato direttamente sotto l'illuminazione UV della microscopia fluorescente. Neuroni etichettati fluorogoldi sono stati trovati in tutti e tre i rami del TG, con concentrazioni più elevate sulle divisioni oftalmiche e mascellari e con concentrazioni più basse sulla divisione mandibolare. Alcuni dei neuroni etichettati fluorogold sono stati osservati anche nelle DRG cervicali da due a tre.Queste fotografie rappresentative a doppia immunofluorescenza mostrano neuroni sensoriali in TG e DRG. I neuroni etichettati con FG, CGRP e sia FG che CGRP sono stati visualizzati da doppia immunofluorescenza. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di sezionare completamente il mater dura craniciale e incollarlo su una diapositiva in un intero modello di montaggio.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli radicali dorsali intatti. J. Vis. Exp. (2023). Il video mostra una tecnica di imaging del calcio in vivo per monitorare l'attività neuronale nei gangli della radice dorsale (DRG) di un topo transgenico. I neuroni DRG esprimono un indicatore di calcio che aumenta l'intensità della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Gli stimoli meccanici o termici applicati a una...

Imaging del calcio in vivo di insiemi neuronali nei gangli della radice dorsale intatti di un topo

Fonte: Wang, J., et al. Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva del peptide correlato al gene della calcitonina della dura madre cranica di ratto con immunofluorescenza e tracciamento neurale. J. Vis. Exp. (2021).  Questo video mostra un metodo per tracciare le origini dei neuroni sensoriali nella dura madre utilizzando la microscopia a fluorescenza. Un tracciante retrogrado viene introdotto nella dura madre esposta di un ratto anestetizzato. Il tracciante viene assorbito dagli assoni...

Indagine sulle origini dei neuroni sensoriali nella dura madre mediante microscopia a fluorescenza

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

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Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

Scopri la visualizzazione 3D delle fibre nervose CGRP e dei vasi sanguigni nella dura madre cranica del topo usando immunofluorescenza e tracciamento neurale retrogrado. Questo metodo avanzato permette di studiare le interazioni neurovascolari.

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Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

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