Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale
6 gennaio 2021
Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l'origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.
Questo protocollo può fornire un riferimento metodologico variabile per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranici sulla condizione fisiologica o patologica. Sfruttando la dura mater trasparente a montaggio intero, la correlazione spettrale delle fibre nervose immunoreattive CGRP durali e dei vasi sanguigni può essere dimostrata in una vista 3D. Dopo aver eutanasiato un ratto, lo ha perfuso trascardialmente con 100 millilitri dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250 a 300 millilitri di paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1.
Al termine, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Sezionare il dura mater cranici lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo in un intero modello di montaggio. Risciacquare il dura mater craniciale in tampone di fosfato molare 0,1 per circa un minuto e incubarlo in una soluzione di blocco.
Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo durante la notte. Il giorno seguente, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0,1. Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 e phalloidin 568 in 0,1.
Tampone fosfato molare contenente l'1% di siero normale di asino e lo 0,5%Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare il dura mater tre volte in tampone di fosfato molare 0.1, tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio. Mettere in coperchio scivola con il 50% di glicerina prima dell'osservazione.
Immagini l'intero supporto dura mater con un microscopio fluorescente, quindi scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con falloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Radere la testa del topo con un rasoio elettrico, quindi mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Posizionare il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
Pulire il lato chirurgico della pelle della testa utilizzando il 75% di etanolo e fare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone. Praticare un piccolo foro usando un trapano a bava con una punta rotonda sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'arteria meningea centrale.
Costruisci una banca intorno al foro con cemento silicato dentale e aggiungi due microlitri di fluorogold nel foro intorno all'arteria meningea centrale con un microsiringe da 10 microlitri. Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica. Metti un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigilla i bordi con cera ossea.
Suturare la ferita con filo sterile. Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi. Quindi riporta i topi nelle loro gabbie.
Dopo sette giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti con soluzione salina normale dello 0,9%, seguita da paraformaldeide al 4% in tampone di fosfato molare 0,1. Sezionare il TG e la cervicale da uno a quattro DDG, quindi tagliarli allo spessore di 30 micrometri su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale. E montare le sezioni su vetri rivestiti di silane.
Cerchiare le sezioni con una penna istochimica e incubarle per 30 minuti in soluzione di blocco. Trasferire i campioni nella soluzione di anticorpi anti-fluorogoldi e topi anti-CGRP del coniglio e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte in tampone di fosfato molare 0,1.
Incubare le sezioni lavate in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 594 e anti-topo di asino Alexa Fluor 488. Quindi lavarli tre volte in tampone di fosfato molare 0,1 e applicare scivolamenti di copertura con 50% glicerina per l'osservazione. Scatta immagini dei neuroni etichettati fluorogold in TG e DRG sotto illuminazione UV usando un microscopio fluorescente.
Quindi, cattura le immagini dei neuroni etichettati fluorogold e CGRP nei TG e nei DRG. Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali etichettate con phalloidin e i tessuti connettivi sono stati chiaramente visualizzati in tutto il montante dura mater cranico in un modello 3D. Sia le fibre nervose immunoreattive CGRP spesse che sottili corrono in parallelo alle arterie uditive intorno alla parete vascolare o tra i vasi sanguigni.
Sette giorni dopo l'applicazione del fluorogoldo sulla regione dell'arteria meningea media e della dura madre cranica del ratto, i neuroni etichettati fluorogold sono stati rilevati nei TG e nelle DRAG cervicali sul lato ipsilaterale dell'applicazione del tracciante, che è stato osservato direttamente sotto l'illuminazione UV della microscopia fluorescente. Neuroni etichettati fluorogoldi sono stati trovati in tutti e tre i rami del TG, con concentrazioni più elevate sulle divisioni oftalmiche e mascellari e con concentrazioni più basse sulla divisione mandibolare. Alcuni dei neuroni etichettati fluorogold sono stati osservati anche nelle DRG cervicali da due a tre.
Queste fotografie rappresentative a doppia immunofluorescenza mostrano neuroni sensoriali in TG e DRG. I neuroni etichettati con FG, CGRP e sia FG che CGRP sono stati visualizzati da doppia immunofluorescenza. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di sezionare completamente il mater dura craniciale e incollarlo su una diapositiva in un intero modello di montaggio.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la visualizzazione della correlazione spaziale tra fibre nervose immunoreattive al peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e vasi sanguigni nella dura madre cranica mediante immunofluorescenza. Il metodo prevede l'applicazione di un tracciante neuronale fluorescente per il tracciamento retrogrado, al fine di comprendere in modo più dettagliato la struttura neurovascolare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Interazioni neurovascolari
- Tecniche di immunofluorescenza
Sfondo
- Comprendere le strutture neurovascolari è fondamentale sia per le condizioni fisiologiche che per quelle patologiche.
- Il CGRP è un neuropeptide significativo coinvolto nella regolazione del dolore e della funzione vascolare.
- La visualizzazione tridimensionale delle fibre nervose e dei vasi sanguigni migliora la comprensione delle loro interazioni.
Scopo dello studio
- Fornire un riferimento metodologico per l'analisi delle interazioni tra CGRP e vasi sanguigni nel dura madre cranico.
- Utilizzare un preparato istologico intero trasparente per una migliore visualizzazione della correlazione spaziale.
- Tracciare l'origine delle fibre nervose che innervano il dura madre.
Metodi Utilizzati
- Immunofluorescenza su preparato intero della dura madre cranica.
- Utilizzo di un modello ratto dopo eutanasia e perfusione per la preparazione del tessuto.
- La dura madre cranica viene incubata con anticorpi specifici per l'immagine delle fibre nervose e dei vasi sanguigni.
- Utilizzo di un microscopio confocale per l'acquisizione di immagini di strutture marcate con fluorescenza.
Risultati principali
- Il protocollo permette una chiara visualizzazione delle fibre nervose immunoreattive al CGRP accanto ai vasi sanguigni marcati con falloidina.
- La doppia immunofluorescenza rivela l'organizzazione spaziale e i modelli di distribuzione dei neuroni marcati nei gangli trigeminali (TG) e nei gangli dorsoradicolari cervicali (DRGs).
- Sono state riscontrate concentrazioni più elevate di neuroni marcati a seguito dell'applicazione mirata del tracciante, indicando una metodologia di tracciamento efficace.
Conclusioni
- Questo studio permette un'analisi dettagliata delle interazioni neurovascolari nella dura madre cranica, fornendo informazioni utili per future ricerche sul dolore e sulla regolazione vascolare.
- I risultati metodologici contribuiscono alla comprensione della mappatura dei neuroni sensoriali in diversi modelli di studio.
- Le implicazioni riguardano anche la ricerca su condizioni neurologiche in cui la dinamica neurovascolare svolge un ruolo cruciale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente una mappatura dettagliata dell'innervazione sensitiva immunoreattiva al CGRP e della sua relazione spaziale con la vascolarizzazione della dura madre cranica, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici nell'ambito delle terapie per emicrania e cefalee. Combinando immunofluorescenza, ricostruzione 3D e tracciamento retrogrado, il metodo fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per i bersagli neurovascolari coinvolti nella trasmissione del dolore. L'approccio offre un'elevata capacità predittiva nella valutazione dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso in modelli preclinici di disturbi neurovascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga l'origine anatomica e la distribuzione dei neuroni sensoriali esprimenti CGRP per validare i percorsi del ganglio trigemino e dei gangli della radice dorsale cervicali come bersagli terapeutici.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale del bersaglio correlando i pattern delle fibre immunoreattive al CGRP con le reti vascolari in una preparazione durale fisiologicamente rilevante.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara preparazioni standardizzate del dura madre in toto per la valutazione quantitativa della co-localizzazione neurovascolare e della densità di innervazione.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità del saggio attraverso il montaggio trasparente dei tessuti e l’imaging tridimensionale, facilitando letture costanti tra diversi lotti sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mappa le origini dei neuroni positivi per CGRP nel ganglio trigemino e nei gangli radicolari dorsali cervicali, consentendo l'allineamento di biomarcatori traslazionali per le vie nocicettive durali.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare gli effetti della modulazione del bersaglio sulle interazioni neurovascolari nei modelli preclinici del dolore.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo dati anatomici e funzionali che orientano la selezione delle target e la comprensione dei meccanismi prima degli sforzi di identificazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione neurovascolare mediati dal CGRP nella dura madre.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la visualizzazione standardizzata delle relazioni spaziali tra fibre nervose e vasi.
- Analisi: Produce output quantitativi di imaging sui modelli di innervazione e sulla distribuzione dei neuroni marcati con traccianti, per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati sull'innervazione durale alla continuità preclinica identificando i corpi cellulari neuronali nei gangli trigeminali e nei gangli radicolari dorsali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di mappatura neurovascolare applicabile a diversi bersagli di neuropeptidi e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'innervazione sensoriale della dura madre.
- Valore operativo: Fornisce una preparazione e un'acquisizione di immagini standardizzate e riproducibili per allineare i team multidisciplinari.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo chiarezza anatomica sui siti di interazione dell'obiettivo nella fisiopatologia dei disturbi cefalalgici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei modulatori della via del CGRP sulla base di una comprovata interazione neurovascolare con l'obiettivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione neuroanatomica, nell'etichettatura mediante immunofluorescenza e nella microscopia confocale.
- Presuppone l'accesso a microtomo, criostato e infrastrutture per l'imaging fluorescente necessarie per l'analisi di preparati interi e di sezioni.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di somministrazione del tracciante e di perfusione tra diversi laboratori per ottenere risultati di tracciamento riproducibili.
- Richiede opportune adattamenti quando il metodo viene applicato a specie diverse o a preparati durale alterati da patologie.
- I limiti pratici includono la variabilità della trasparenza del tessuto e i vincoli alla diffusione del tracciante, che influiscono sulla fedeltà della ricostruzione tridimensionale.
