Trapianto intramiocardico di idrogel iniettabili a carico MSC dopo infarto del miocardio in un modello murino

Questo metodo può aiutare ad affrontare i problemi chiave dell'attuale terapia cardiaca esacerbata, come la bassa applicabilità alla bassa ritenzione e la sopravvivenza delle cellule trapiantate nei cuori infartuati. Per affrontare questo problema, questo metodo può fornire una tecnica affidabile per studiare il trapianto intramiocardico con cellule staminali utilizzando idrogel iniettabili in un modello murino, che è un'eccellente piattaforma da utilizzare per studiare la riparazione e la rigenerazione del tessuto cardiaco dopo un'infrazione miocardica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo fattibile per migliorare la ritenzione e la sopravvivenza delle cellule staminali trapiantate dopo il trapianto intra-miocardico utilizzando idrogel iniettabili con copertura cross-link in situ.

Questi idrogel offrono diverse opportunità per l'ingegneria del tessuto cardiaco, come la somministrazione non solo di cellule staminali, ma anche di fattori di crescita, materiali genetici e farmaci per massimizzare il loro effetto terapeutico nei tessuti cardiaci infartuati. A dimostrare la procedura per l'esperimento in vitro sarà Eunmi Lee, una tecnologa di ricerca del mio laboratorio. I tecnologi di ricerca Eun-Hye Park e Eunhwa Seong dimostreranno la procedura per gli esperimenti in vivo.

Coltura di cellule staminali mesenchimali, o MSC, in un piatto di coltura da 100 millimetri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, lavare il piatto due volte con DPBS e incubarle con un millilitro di sostituto della tripsina a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi aggiungere nove millilitri di terreno di coltura alle cellule e centrifugarle a 500 volte G per tre minuti.

Scartare il surnatante risultante. Risospendere le cellule in un millilitro di PBS e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Diluire 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di blu di tripano e determinare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule automatizzato.

Risospendere le MSC a una densità di una volta per 10 al settimo cellulare per millilitro e trasferirle in una provetta da un millilitro. Preparare una soluzione coniugata al 6,25% di GH in PBS e separarla in due fiale. Successivamente, mescolare le soluzioni di GH con sei microgrammi per millilitro di HRP o perossido di idrogeno allo 0,07%.

Centrifugare brevemente la sospensione cellulare a 1000 volte G e aspirare con cura il surnatante risultante. Quindi mescolare il pellet cellulare con la soluzione di GH A.Caricare le MSC nella soluzione di GH A e nella soluzione di GH B su entrambi i lati di una siringa doppia. Piastra 300 microlitri di soluzioni combinate di GH con MSC a una densità finale di 5 milioni di cellule per millilitro su un vetrino a otto pozzetti.

Dopo la formazione in situ dell'idrogel e il successivo incapsulamento delle MSC tramite reticolazione enzimatica, aggiungere 700 microlitri di DMEM contenenti il 10% di FBS e l'1% di soluzione antimicotica antibiotica. Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica e sostituire il terreno di coltura ogni due o tre giorni. Prima dell'intervento chirurgico, depolare il torace del topo utilizzando una crema depilatoria e sterilizzare la pelle con iodio.

Posizionare il mouse su un tavolo operatorio e intubarlo inserendo un catetere nella trachea per fornire ossigeno supplementare tramite ventilazione meccanica. Tagliare delicatamente la pelle con le forbici chirurgiche. Quindi penetrare i muscoli intercostali con micro forbici.

Separare la seconda e la terza costola sinistra utilizzando una sutura di seta 5-O per mantenere una cavità toracica aperta. Legare con cautela l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra utilizzando un porta-aghi con un 8-0 sutura in polipropilene e tagliare la sutura mediante elettrocauterizzazione. Osservare un immediato cambiamento di colore nella parete ventricolare anteriore sinistra.

Dopo aver indotto l'infarto del miocardio, iniettare 10 microlitri di soluzioni di GH che caricano MSC in due punti diversi nella zona di confine dell'infarto. Ripristinare la cavità toracica aperta e chiudere i muscoli e la pelle utilizzando suture 5-0. Rimuovere il tubo tracheale e posizionare il mouse in una gabbia sotto una lampada a infrarossi durante il recupero.

Eseguire un'ecocardiografia e misurare le linee corrispondenti per la parete anteriore del ventricolo sinistro, la parete interna del ventricolo sinistro e la parete posteriore del ventricolo sinistro per ottenere lo spessore della parete cardiaca, la dimensione della camera e l'accorciamento frazionario. Prima del trapianto in vivo, la proliferazione e la sopravvivenza delle MSC negli hydragels di GH sono state confermate da un saggio di colorazione 3D in vitro di cellule morte vive. Le immagini rappresentative hanno mostrato una sufficiente proliferazione di MSC mostrando reti ramificate all'interno degli idrogel di GH.

Al giorno 14 è stata chiaramente osservata un'estesa struttura 3D multicellulare di MSC, indicando che gli idrogel di GH potrebbero fornire un microambiente adeguato per le cellule incapsulate. Dopo l'induzione dell'infarto miocardico, gli idrogel di GH che caricano MSC sono stati trapiantati intramiocardiologicamente nelle aree peri-infartuali. Le MSC e il gel sono stati adeguatamente sostenuti all'interno della regione infartuata.

Le MSC erano ben integrate negli idrogel di GH. Per verificare gli effetti terapeutici degli idrogel di GH che caricano MSC, i cambiamenti nella funzione e nella struttura cardiaca sono stati valutati mediante ecocardiografia e analisi istologica al giorno 28 dopo il trapianto e confrontati tra i diversi gruppi di trattamento. L'ecocardiografia rappresentativa ha mostrato un miglioramento delle funzioni cardiache, tra cui l'accorciamento frazionario, la frazione di eiezione e il volume telesistolico nel gruppo trattato con gel MSC.

Inoltre, l'analisi istologica ha mostrato meno fibrosi, pareti infartuali più spesse e una dimensione dell'infarto più piccola nel gruppo trattato con gel MSC rispetto agli altri gruppi, indicando che questo protocollo ha attenuato significativamente il rimodellamento del ventricolo sinistro. Utilizzando questa tecnica, abbiamo ottenuto cellule staminali a lungo termine nella proliferazione e abbiamo portato a un miglioramento significativo della struttura e della funzione cardiaca a seguito di infarto del miocardio in modello murino. Questa tecnica può essere estesa per l'uso in animali di grossa taglia e per la traduzione clinica come nuova strategia per la prevenzione di un'insufficienza cardiaca post-infarto, fornendo la riparazione e la rigenerazione del tessuto cardiaco.