Frazionamento asimmetrico del flusso campo-flusso per il dimensionamento delle nanoparticelle d'oro in sospensione

L'uso del frazionamento asimmetrico del campo di flusso-flusso in combinazione con la calibrazione delle dimensioni esterne è un potente strumento per determinare con precisione la distribuzione dimensionale delle nanoparticelle d'oro in sospensione. AF4 copre l'intera gamma di dimensioni, da uno a 1000 nanometri. È indipendente dalla composizione del campione dei costituenti del campione e può essere applicato anche a campioni complessi e scarsamente dispersi.

Il bello di AF4 è la sua gamma di applicazioni molto ampia, che copre non solo nanoparticelle di diversa natura e dimensione, ma include anche proteine, virus o macromolecole sintetiche o naturali. Inizia facendo vorticare 50 milligrammi per litro di uno standard arbitrario di nanoparticelle d'oro per due minuti prima di diluire lo standard in un rapporto da uno a quattro con acqua ultrapura. Quindi agitare la soluzione diluita per altri due minuti per ottenere una sospensione omogeneizzata.

Dopo aver pulito il sistema, aprire la cartuccia AF4 per consentire la sostituzione della membrana AF4. Sciacquare la nuova membrana con UPW e rimontare la cartuccia. Quindi ricollegare la cartuccia al sistema AF4-UV-vis.

Lavare il sistema AF4-UV-vis pulito con eluente filtrato e degassato per almeno 30 minuti applicando una portata di punta di un millilitro al minuto, una portata di messa a fuoco di un millilitro al minuto e una portata trasversale di 1,5 millilitri al minuto, per equilibrare la membrana, stabilizzare il sistema e verificare la presenza di potenziali perdite. La pressione del sistema deve raggiungere un livello costante compreso tra quattro e 12 bar. Per qualificare il sistema AF4-UV-vis determinando il recupero di massa e la variazione del tempo di ritenzione utilizzando uno standard di dimensione arbitrario delle nanoparticelle d'oro, eseguire una corsa di iniezione diretta senza l'applicazione di una forza di separazione.

Quindi eseguire una corsa di frazionamento con l'applicazione di una forza di separazione. Per preparare gli standard dimensionali delle nanoparticelle d'oro per il vortice di calibrazione delle dimensioni esterne, tutti gli standard dimensionali delle nanoparticelle d'oro da 50 milligrammi per litro per due minuti e diluire ogni rispettivo campione per l'analisi in acqua ultrapura in un rapporto da uno a quattro. Una volta preparati gli standard dimensionali, nella scheda Metodo FFF impostare la portata del rivelatore a 500 microlitri al minuto, la portata di iniezione a 500 microlitri al minuto e il tempo di iniezione a 0,1 minuti.

Impostare una durata dell'eluizione di otto minuti senza una forza di separazione definita e iniettare 10 microlitri del primo standard nel sistema. Quando tutti gli standard dimensionali sono stati misurati, iniettare 50 microlitri del primo standard nel sistema. Impostare la portata del rilevatore su 500 microlitri al minuto.

Impostare il ritardo a due minuti, la portata di iniezione a 200 microlitri al minuto per cinque minuti e il tempo di transizione a 0,2 minuti. La portata di messa a fuoco verrà calcolata automaticamente. Impostare la durata dell'eluizione su 60 minuti e la portata trasversale su un millilitro al minuto.

Questo metodo AF4 utilizza una velocità di flusso incrociato costante che è seguita da un decadimento lineare in 10 minuti fino a zero microlitri al minuto. Impostare la fase di risciacquo di nove minuti con una portata della punta di 500 microlitri al minuto. Quando tutti gli standard di dimensione delle nanoparticelle d'oro sono stati frazionati, preparare il campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto ed eseguire una misurazione diretta dell'iniezione diretta e il frazionamento del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto come appena dimostrato.

Per analizzare i dati, importare i file di dati nel software di sistema. Visualizzare le misurazioni nella scheda Panoramica e selezionare il segnale del rivelatore UV-VIS dall'elenco dei rilevatori. Definisci una regione di interesse e una linea di base per ogni misurazione, regolando il segnale e la vista della linea di base secondo necessità.

Utilizzare la casella degli strumenti di elaborazione del segnale per attenuare eventuali segnali rumorosi e utilizzare la funzione di assegnazione dei parametri di elaborazione ad altre esecuzioni per consentire l'assegnazione dei parametri ad altre misurazioni. Per eseguire un calcolo del recupero di massa, aprire le misurazioni dell'iniezione diretta e i dati di frazionamento. Inserire una calibrazione dell'iniezione diretta e selezionare le rispettive misurazioni dell'iniezione diretta dalla vista delle impostazioni di calibrazione dell'iniezione diretta.

Il volume di iniezione e la concentrazione del campione verranno utilizzati per correlare l'area del picco con la quantità iniettata. Quindi, utilizzare la funzione Assegna alle preimpostazioni delle particelle selezionate per assegnare la funzione di calibrazione ottenuta alle rispettive misure di frazionamento. Quindi, utilizzare l'equazione per calcolare il recupero di massa delle nanoparticelle d'oro confrontando l'area sotto i rispettivi picchi UV-vis delle misurazioni di frazionamento e iniezione diretta.

Per visualizzare i risultati, aprire il calcolo quantitativo dei risultati. Verrà presentata una concentrazione di massa basata sull'area del picco. Il recupero di massa può essere ottenuto confrontando questo valore con la concentrazione iniettata.

Nella scheda della dimensione delle particelle nella finestra di calibrazione della dimensione delle particelle, fare clic su ciascuna misurazione appropriata nella tabella di selezione dei riferimenti per la calibrazione per selezionare tutte le esecuzioni di calibrazione. Le misure verranno visualizzate in una tabella man mano che vengono selezionate. Inserire il raggio idrodinamico per tutte le misure di calibrazione.

La funzione e l'equazione verranno visualizzate nella finestra della funzione di calibrazione della dimensione delle particelle. Per assegnare la funzione di calibrazione alle misurazioni del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto, selezionare i rispettivi frazionamenti all'interno dell'elenco di selezione per l'assegnazione e aprire un calcolo della distribuzione granulometrica per visualizzare i risultati. La dimensione calcolata verrà mostrata nella finestra di distribuzione delle dimensioni, etichettata fino al picco massimo.

E la calibrazione della dimensione delle particelle creata in precedenza sarà elencata come la calibrazione per le misurazioni del campione di nanoparticelle d'oro sconosciute. Per calcolare la media di tutte le misurazioni di un campione, selezionare la casella di controllo Media segnali per campione. Il risultato verrà elencato nell'etichetta del picco massimo.

Qui, viene mostrata una sovrapposizione rappresentativa di standard dimensionali di nanoparticelle d'oro frazionate da AF4 e rilevate mediante misurazione spettroscopica UV-vis dell'assorbanza delle particelle a una lunghezza d'onda di 532 nanometri. La deviazione standard relativa di tutti i tempi di ritenzione per ciascuna nanoparticella al rispettivo picco massimo di spettroscopia UV-vis ottenuta da misurazioni triplicate era inferiore all'1,1%Un'analisi di regressione lineare di questi dati ha portato a una funzione di calibrazione lineare con un coefficiente di correlazione al quadrato, R al quadrato, di 0,9958. Quando nove fractogrammi di spettroscopia AF4-UV-vis sono stati ottenuti da campioni di nanoparticelle d'oro sconosciuti, la deviazione standard relativa dei rispettivi tempi di ritenzione era significativamente bassa, compresa tra 0,1 e 0,5% Utilizzando la funzione di calibrazione della dimensione delle particelle ottenuta dal frazionamento degli standard dimensionali delle nanoparticelle d'oro e correlando questi dati con i tempi di ritenzione ottenuti del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto al massimo picco della spettroscopia UV-vis, È stato possibile calcolare un raggio idrodinamico medio complessivo.

Inoltre, è stato possibile ottenere un ragionevole recupero di massa che indichi l'assenza di agglomerazione o dissoluzione significativa dei campioni di nanoparticelle d'oro o un notevole adsorbimento delle particelle sulla superficie della membrana. Quando si utilizza una calibrazione delle dimensioni esterne e un'analisi AF4, è della massima importanza che lo stesso metodo AF4 venga applicato in modo coerente a tutti gli standard dimensionali e al campione stesso. AF4 consente ai ricercatori di comprendere meglio le proprietà dei loro campioni di nanoparticolato.

Si tratta quindi di un importante strumento di controllo della qualità che, in ultima analisi, contribuisce a migliorare l'efficacia dei prodotti nano-abilitati.