Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT
14 dicembre 2020
Le alterazioni indotte da antimicrobici dell'architettura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa differiscono tra gli isolati clinici coltivati da pazienti con fibrosi cistica e infezione polmonare cronica. Dopo la microscopia confocale, il software COMSTAT può essere utilizzato per quantificare le variazioni nell'architettura del biofilm (ad esempio, area superficiale, spessore, biomassa) per i singoli isolati per valutare l'efficacia degli agenti anti-infettivi.
L'importanza di questo protocollo è che offre un quadro semplice e riproducibile per quantificare le strutture del biofilm in vitro in condizioni antimicrobiche variabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a eliminare le variazioni soggettive associate al funzionamento manuale di COMSTAT, il che in ultima analisi facilita la standardizzazione e la trasparenza degli esperimenti tra i centri di ricerca. Per visualizzare le colture di Pseudomonas aeruginosa, posizionare la piastra sul tavolino di un microscopio confocale, dotato delle lunghezze d'onda di eccitazione laser e dei set di filtri appropriati.
Inoltre, utilizza una lente a immersione in acqua da 20 a 25x per acquisire almeno sei immagini z-stack stratificate dal substrato alla parte superiore di ciascun segmento di biofilm con incrementi di 0,3 micrometri. Quindi salva le immagini come OME-TIFF per l'analisi COMSTAT. Una volta acquisite tutte le immagini, aprire il pacchetto COMSTAT2 in ImageJ e creare una cartella di origine sul desktop.
Aggiungere un singolo OME-TIFF alla cartella e aprire OME-TIFF dalla cartella di origine. Elimina tutti gli strati vuoti che non contengono biomassa. Selezionate File, Importa e Sequenza immagini per importare il file in ImageJ.
Individua ed evidenzia la cartella di origine senza aprirla e fai clic su Seleziona. Apparirà una finestra di opzioni di sequenza, fare clic su OK. Seleziona Immagine, Trasforma e Capovolgi Z per capovolgere l'orientamento del biofilm in modo che il substrato si trovi nella parte superiore della pila. Per definire le proprietà dell'immagine, selezionare Immagine e Proprietà, apparirà una finestra sorgente.
Specificare l'unità di lunghezza in micron, definire la profondità del voxel in 0,3 e fare clic su OK. Selezionare Immagine, Regola e Soglia. Per regolare la soglia dell'immagine nella finestra della soglia, posizionare il cursore inferiore all'estrema destra per impostare manualmente il valore di soglia massimo e utilizzare il cursore superiore per impostare la soglia minima. Quindi utilizzare il cursore nella finestra dell'immagine per scorrere ogni livello per assicurarsi che il rumore di fondo venga rimosso a sufficienza in tutta la pila e selezionare Imposta per fissare il valore di soglia inferiore.
Nella finestra Imposta livelli di soglia, selezionare OK e impostare e fissare il valore di soglia massimo in modo analogo. Selezionare Applica, fare clic su OK nella finestra Converti stack in binario visualizzata e uscire dalla finestra di soglia. Selezionate Plugin, Bio-Formats e Bio-Formats Exporter per salvare il file con un nuovo nome nella cartella di origine.
Apparirà una finestra di file multipli di Bio-Formats Exporter, selezionare OK. Apparirà una finestra delle opzioni dell'esportatore di formati biologici, seleziona di nuovo OK. Per eseguire COMSTAT, selezionare i plug-in e COMSTAT2, apparirà una finestra di informazioni, selezionare OK.In finestra Directory osservate, selezionare Aggiungi, individuare ed evidenziare la cartella di origine, evidenziare e fare clic su Scegli. Apparirà una finestra Immagini nelle directory che elenca gli OME-TIFF da analizzare.
Nella finestra COMSTAT2.1, deselezionare Metodo di soglia automatica Otsu e Filtro volume connesso per assicurarsi che il software utilizzi valori di soglia preimpostati per i singoli OME-TIFF. Nella finestra COMSTAT2.1, selezionare Biomassa, Distribuzione spessore e Area superficiale, quindi fare clic su Vai per eseguire il programma. I dati di output verranno visualizzati nella finestra del registro.
Le misurazioni verranno salvate automaticamente come file TXT nella cartella di origine. In questa analisi rappresentativa, un isolato di Pseudomonas aeruginosa, coltivato da un paziente infetto con fibrosi cistica, è stato utilizzato per dimostrare i punti di forza di questo approccio, quantificando in modo impreciso i cambiamenti indotti da antimicrobici nell'architettura del biofilm in vitro. L'imaging di cellule vive può anche visualizzare i cambiamenti nella struttura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa prima e dopo il trattamento monoclonale e tobramicina specifici per biofilm.
L'analisi dei dati COMSTAT ha rivelato differenze significative tra le strutture del biofilm trattate rispetto alle colture di controllo. Nelle colture trattate con tobramicina è stata osservata una netta riduzione dello spessore medio e della biomassa. Tuttavia, in presenza di anticorpi, il biofilm di P.aeruginosa era resistente a questi cambiamenti strutturali indotti dalla tobramicina.
Esaminando il rapporto tra superficie e biovolume, è stata osservata una riduzione significativa della presenza di anticorpi sia nei biofilm esposti alla tobramicina che in quelli non esposti, indicando la formazione di aggregati nelle colture trattate con anticorpi. Questa procedura può essere eseguita per valutare quantitativamente o confrontare gli effetti di diversi antimicrobici utilizzati per distruggere le matrici di biofilm. Utilizzando questa tecnica come quadro generale, i ricercatori possono esplorare diversi modi per perfezionare il protocollo per includere nuovi modelli matematici e plug-in algoritmici in ImageJ per rappresentare meglio l'eterogeneità del biofilm.
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Panoramica
Questo studio presenta un framework riproducibile per la quantificazione delle strutture del biofilm di Pseudomonas aeruginosa in diverse condizioni antimicrobiche. Il protocollo mira a standardizzare la valutazione dell'architettura del biofilm, migliorando la trasparenza tra i diversi centri di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Ricerca sui biofilm
- Efficacia antimicrobica
Sfondo
- Pseudomonas aeruginosa è un patogeno comune nei pazienti affetti da fibrosi cistica.
- L'architettura del biofilm può influenzare gli esiti del trattamento.
- La quantificazione delle caratteristiche del biofilm è essenziale per valutare gli agenti anti-infettivi.
- Il software COMSTAT fornisce un metodo per l'analisi oggettiva dei biofilm.
Scopo dello studio
- Quantificare le variazioni nell'architettura del biofilm tra isolati clinici.
- Valutare l'efficacia di diversi agenti antimicrobici.
- Eliminare le variazioni soggettive nell'analisi del biofilm.
Metodi Utilizzati
- Microscopia confocale per l'acquisizione di immagini di strutture di biofilm.
- Software COMSTAT per la quantificazione delle caratteristiche del biofilm.
- Utilizzo di un obiettivo ad immersione in acqua da 20 a 25x per l'acquisizione delle immagini.
- Acquisizione di immagini a stack z con incrementi di 0,3 micrometri.
Risultati principali
- Sono state osservate variazioni nella struttura del biofilm tra diversi isolati.
- Il protocollo ha permesso un'analisi standardizzata tra esperimenti.
- L'analisi COMSTAT ha fornito metriche oggettive per la valutazione del biofilm.
- L'efficacia antimicrobica è stata valutata in base alle caratteristiche del biofilm.
Conclusioni
- Il protocollo migliora la riproducibilità nella ricerca sui biofilm.
- La standardizzazione aumenta l'affidabilità dei risultati sperimentali.
- Studi futuri potranno basarsi su questo schema per ulteriori indagini.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione standardizzata degli effetti antimicrobici sull'architettura del biofilm supporta la validazione degli obiettivi nello sviluppo di agenti anti-infettivi. Metriche oggettive del biofilm permettono una riduzione del rischio meccanicistica dei candidati terapeutici, collegando l'esposizione al composto agli esiti strutturali. Questo approccio migliora l'affidabilità predittiva della selezione preclinica riducendo la variabilità nella valutazione del fenotipo del biofilm tra diversi laboratori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi antimicrobici quantificando le variazioni nello spessore del biofilm, nella biomassa e nel rapporto superficie-volume biologico.
- Valore operativo: Riduce la variabilità soggettiva nell'analisi delle immagini, supportando valutazioni riproducibili dell'interazione con il bersaglio in diversi siti.
- Valore predittivo: Facilita decisioni di tipo go/no-go fornendo soglie quantitative di efficacia antibiofilm.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative standardizzate (biomassa, distribuzione dello spessore, area superficiale) per campagne di screening di composti.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro di imaging e analisi riutilizzabile, compatibile con piattaforme confocali ad alto contenuto informativo.
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi di biofilm validati per la valutazione successiva di agenti antimicrobici o antibiofilm.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i fenotipi di biofilm in vitro a isolati clinicamente rilevanti di Pseudomonas aeruginosa provenienti da infezioni in pazienti con fibrosi cistica.
- De-risking Meccanicistico: Distingue tra gli effetti antimicrobici sulla struttura del biofilm e sulla vitalità batterica, chiarificando la modalità d'azione.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta la priorizzazione di composti in grado di alterare l'architettura del biofilm senza indurre fenotipi di resistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo un fenotipaggio quantitativo dei biofilm per informare le relazioni struttura-attività.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando il trattamento antimicrobico a modifiche misurabili nell'architettura del biofilm.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità del saggio mediante impostazioni di soglia fisse ed eliminazione della segmentazione dipendente dall'operatore.
- Analisi: Fornisce risultati oggettivi e quantitativi (biomassa, spessore, area superficiale) che consentono il confronto diretto tra diverse condizioni antimicrobiche.
- Ricerca traslazionale: Utilizza isolati di P. aeruginosa rilevanti per la malattia per migliorare la continuità preclinica e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un quadro standardizzato adattabile ad altri patogeni formatori di biofilm o classi di antimicrobici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'attività antibiofilm riducendo al minimo l'interpretazione errata delle strutture eterogenee del biofilm.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la confrontabilità tra laboratori eliminando le variazioni soggettive nell'uso di COMSTAT.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo i fallimenti nelle transizioni precliniche dovuti a effetti del biofilm scarsamente caratterizzati.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, basate su soglie quantitative di interruzione del biofilm.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale ed elaborazione delle immagini per l'acquisizione e la pre-elaborazione di z-stack.
- È subordinato all'accesso a microscopi confocali a scansione laser dotati di lunghezze d'onda di eccitazione adeguate e obiettivi ad immersione in acqua 20–25x.
- Necessita di una formattazione standardizzata delle immagini (OME-TIFF) e di un'organizzazione gerarchica delle cartelle per l'analisi batch con COMSTAT2.
- Richiede considerazioni di adattamento quando applicato a diversi modelli di biofilm o meccanismi antimicrobici.
- È limitato dal tempo necessario per la pre-elaborazione manuale delle immagini prima dell'analisi automatizzata con COMSTAT.
