Name: Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri la tecnica di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi per studiare l'ernia diaframmatica congenita e lo sviluppo polmonare. Questo metodo reversibile riduce i costi e la mortalità animale.

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Questa ricerca non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica dalle agenzie di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro. Tutti gli autori hanno dato contributi sostanziali all'ideazione e alla progettazione dello studio, all'acquisizione, all'analisi e all'interpretazione dei dati, redigendo l'articolo e rivederlo per importanti contenuti intellettuali e approvazione finale della versione da presentare. Gli autori ringraziano Can Sabuncuoğlu per i suoi gentili sforzi nella produzione dell'opera d'arte della tecnica chirurgica.

Tutti gli esperimenti sono stati conformi alla Guida nazionale degli istituti sanitari per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (PUBBLICAZIONI N. 80023 del NIH, rivedute nel 1978). La procedura è stata approvata con il protocollo IACUC #2016-0068 dal Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione
<ol><li>Per accoppiare topi C57BL/6 di tipo selvaggio abbinati all.m'età (WT), metterli nella stessa gabbia alle 18:00.m e separarli alle 9:00 del giorno successivo.</li>
	<li>Per determinare il giorno 0 embrionale (E0), guardare la spina vaginale, che ha una zona esterna omogenea attaccata alla parete vaginale e una zona interna fibrosa e include alcuni spermatozoi che formano masse impigliate mescolate con le fibre del materiale della spina.</li>
	<li>Registrare il peso dei topi al momento dell'accoppiamento.</li>
	<li>Ri pesare i topi sull'E10 per garantire una gravidanza in corso.</li>
	<li>Eseguire l'intervento chirurgico su E16.5 (fase canalicolare precoce).</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti che verranno utilizzati durante l'intervento chirurgico: forbici, porta ago, pinze, morsetti e coltelli chirurgici e maniglie.</li>
	<li>Preriparare la piattaforma chirurgica a 24 °C e preparare la soluzione salina calda (24 °C) prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Crea un ambiente caldo per il recupero e lascia il cibo umido all'interno della gabbia per l'alimentazione precoce.</li>
	<li>Resta con gli animali gestiti fino a quando non possono nutrirsi da soli.</li>
	<li>Tenere i topi operati da soli nelle loro gabbie individuali dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Applicare sottocutaneo 0,1 mg/kg di buprenorfina sulle dighe gravide 1 h prima della procedura.</li>
	<li>Utilizzare continuamente 5 mL/h di isoflurane per l'induzione e 2 mL/h continuamente durante la procedura per l'anestesia.</li>
	<li>Monitorare i movimenti dei cinguettii dei topi gravidi.</li>
</ol>3. Laparotomia
<ol><li>Pulire la superficie addominale con alcool e povidone-iodio. Mantenere condizioni sterili durante l'operazione.</li>
	<li>Eseguire un'incisione verticale per la laparotomia delle dighe gravide. Tagliare tutti i livelli separatamente.</li>
	<li>Identificare le corna uterine su ciascun lato.</li>
	<li>Determinare i feti candidati per l'intervento. NOTA: Non operare sui feti più vicini alla vagina.</li>
	<li>Operare su due feti in ogni corno uterino se ci sono un numero pari di feti su ciascun lato (4 il più delle volte), e su 1 feto in ogni corno uterino se c'è un numero dispari di utero (3 la maggior parte delle volte).</li>
</ol>4. Occlusione tracheale
<ol><li>Utilizzare occhiali di ingrandimento 2,5x per la visualizzazione.</li>
	<li>Posizionare il corno uterino in modo trasversale.</li>
	<li>Prendi i cuccioli, rivolti verso l'alto, tra due dita usando gli occhi dei cuccioli e la coda come guida per posizionare il feto.</li>
	<li>Applicare una leggera pressione sulla testa del cucciolo per consentire l'estensione della testa e quindi la visualizzazione del collo.</li>
	<li>Utilizzare una sutura in polipropilene 6.0 con un ago atraumatico per eseguire TO (Figura 1). Tenere la placenta sul lato e lontano dai punti di ingresso e di uscita dell'ago.</li>
	<li>Inserire l'ago trasversalmente attraverso il lato dell'utero lontano dalla placenta attraverso la parteanteriore 1/3 del collo.</li>
	<li>Spostare delicatamente l'ago fino alla linea mediana del collo e dirigerlo verso la parte anteriore, quindi uscire dal collo tra la trachea e di fronte alla focaia carotide e all'utero.</li>
	<li>Annodare la sutura, facendo attenzione a mantenere l'integrità delle membrane e della parete uterina e mantenere il cordone ombelicale al sicuro durante il nodo.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61772/61772fig01.jpg"> Figura 1: Occlusione tracheale. (A) La sutura transuterina che passa attraverso il collo. (B) Rappresentazione schematica delle strutture dopo che la sutura passa attraverso e prima del nodo. Abbreviazioni: C = Arteria carotide; J = Vena giugulare; T =Trachea; E = Esofago; V = Vertebra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61772/61772fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Chiusura della parete addominale
<ol><li>Sostituire il corno uterino nell'addome.</li>
	<li>Iniettare 2 mL di salina sterile calda nella cavità peritoneale prima della chiusura.</li>
	<li>Metti una sutura di poliglatina 5/0 da corsa per chiudere la parete addominale e chiudere la pelle con una sutura di seta non funzionante.</li>
	<li>Applicare 0,1 mg/kg di buprenorfina intraperitonealmente per l'analgesia e consentire il recupero della diga in un'incubatrice calda.</li>
</ol>6. Vendemmia
<ol><li>Applicare l'anestesia sulla diga incinta e raccogliere tutti i feti all'E18.5 con la sezione cesarea.</li>
	<li>Controlla la vitalità dei feti osservando i movimenti dei feti.</li>
	<li>Utilizzare almeno due tecniche diverse per l'eutanasia: l'insufflazione di anidride carbonica e la lussazione cervicale.</li>
	<li>Rimuovere i corpi secondo la regolazione del laboratorio veterinario.</li>
	<li>Pesa tutti i feti.</li>
	<li>Eseguire un'incisione verticale sul torace per la toracotomia per rimuovere i polmoni.</li>
	<li>Sezionare i polmoni degli embrioni e pesarli per calcolare il rapporto peso polmonare/corporeo totale (LBWR = (peso polmonare sinistro + peso polmonare destro)/peso corporeo x100).</li>
</ol>7. Istologia
<ol><li>Congelare i tessuti in azoto liquido, composto ottimale della temperatura di taglio e ghiaccio secco.</li>
	<li>Tagliare i campioni in sezioni da 10 μm utilizzando un criostato e montarli su diapositive rivestite in polilisina.</li>
	<li>Cuocere le diapositive a 60 °C durante la notte e macchiare le diapositive al forno con ematossilina ed eosina prima di montarle per l'acquisizione di immagini con ingrandimento 10-20x utilizzando un microscopio a campo largo.</li>
</ol>8. Trattamento tissutale per analisi di proteine e DNA
<ol><li>Congelare i polmoni fetali sezionati e omogeneizzarli in 300 μL di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione. Centrifuga a 4 °C per 5 min a 18.000 × g.</li>
	<li>Estrarre e quantificare proteine, DNA e RNA10,12.</li>
</ol>

<ol><li>Wright, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+PaedSurg+Research+Collaboration.+Management+and+outcomes+of+gastrointestinal+congenital+anomalies+in+low%2C+middle+and+high+income+countries%3A+protocol+for+a+multicentre%2C+international%2C+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study.</a> BMJ Open. 9, 030452(2019).</li>
<li>Aydin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approach+for+prenatally+diagnosed+congenital+anomalies+that+requires+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Clinics+Journal+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery.</a> Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).</li>
<li>Nolan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhage+after+on-ECMO+repair+of+CDH+is+equivalent+for+muscle+flap+and+prosthetic+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).</li>
<li>Aydin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+diaphragmatic+hernia%3A+the+good%2C+the+bad%2C+and+the+tough%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough.</a> Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+congenital+diaphragmatic+hernia-associated+musculoskeletal+deformities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities.</a> Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).</li>
<li>Aydın, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+primary+repair+is+not+enough%3A+a+comparison+of+synthetic+patch+and+muscle+flap+closure+in+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).</li>
<li>Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+fetal+tracheal+ligation+prevents+the+pulmonary+hypoplasia+associated+with+fetal+nephrectomy%3A+Possible+application+for+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).</li>
<li>Mudri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tracheal+occlusion+on+Wnt+signaling+in+a+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).</li>
<li>Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+occlusion%3A+a+review+of+obstructing+fetal+lungs+to+make+them+grow+and+mature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+animal+models+to+human+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).</li>
<li>Varisco, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+reversal+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+ephrin+signaling+following+tracheal+occlusion+in+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo descrive una procedura chirurgica di occlusione tracheale fetale nei topi e il suo impatto sullo sviluppo polmonare. Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che dovrebbero essere eseguiti con attenzione per avere successo. Il calore della piattaforma su cui avviene l'intervento chirurgico e la soluzione salina introdotta nella cavità peritoneale è fondamentale per la progressione della gravidanza. Inoltre, è necessario applicare una leggera pressione sulla testa dei cuccioli per garantire l'esposizio...

L'ernia diaframmatica congenita (CDH) si verifica in gravidanze 1:2500 e si traduce in ipoplasia polmonare e ipertensione polmonare neonatale1,2,3,4,5,6. L'occlusione tracheale fetale (TO) è una terapia prenatale stabilita nei pazienti affetti da CDH grave che coinvolge la fetoscopia nella settimanagestazionale 26-30 in cui un palloncino viene posizionato appena sopra la carena e quindi rimosso nella 32a settimana gestazionale. Questo TO temporaneo induce la crescita polmonare fetale e migliora la sopravvivenza. La sindrome da ostruzione delle alte vie aeree congenite è una condizione letale associata all'iperplasia polmonare, che ha ispirato i chirurghi a eseguire l'occlusione artificiale della trachea per promuovere la ritenzione del liquido epiteliale secreto. Questa occlusione ha aumentato la pressione luminare e indotto la crescita polmonare7. Tuttavia, l'occlusione deve essere invertita per consentire la maturazione delle cellule epiteliali.
Vari modelli animali di CDH e TO - ovino, coniglio, ratto e topo - sono stati sviluppati per comprendere la fisiopatologia di CDH e TO. Tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi come la difficoltà della tecnica, le dimensioni dell'animale, il costo, alti tassi di mortalità e la disponibilità di strumenti genetici. Sebbene la tecnica chirurgica utilizzata per il modello ovino sia molto simile a quella utilizzata nell'uomo e possa essere invertita, i principali inconvenienti di questo modello sono le spese dell'animale, il lungo periodo gestazionale e il numero limitato di interventi chirurgici possibili. Il modello di coniglio ha un periodo gestazionale più breve ed è meno costoso del modello di pecora. Tuttavia, il modello di coniglio è irreversibile8,9. Il modello murino ha il costo più basso, il maggior numero di feti per gravidanza, il genoma meglio caratterizzato e strumenti ampiamente disponibili per le analisi cellulari e molecolari. Tuttavia, uno svantaggio fondamentale è la mancanza di reversibilità dell'TO, che impedisce la piena comprensione dell'impatto di TO. Qui viene presentato un metodo che combina tutti i vantaggi dei modelli precedentemente menzionati e crea un modello to roditore facile, potenzialmente reversibile e minimamente invasivo.

<table><tbody><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Par Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Per anestesia regionale</td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>&nbsp; Halocarbon Life Sciences</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>Per anestesia generale</td></tr><tr><td>Occhiali di ingrandimento</td><td>USA Medico-chirurgico</td><td>SLR-250LBLK</td><td>Almeno 2,5x</td></tr><tr><td>Nikon 90i microscopio</td><td>Nikon</td><td>3417</td><td>Fluorescenza motorizzata</td></tr><tr><td>Nucleospin Tissue Kit&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Germania</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Pierce BCA per l'isolamento del DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher, IL, USA</td><td>23225</td><td>Quantificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Sutura in poliglactina</td><td>Ethicon</td><td>VCP451H</td><td>4-0, 24 mm, taglio</td></tr><tr><td>di vetrini in polilisina&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48382-117</td><td>Vetrini di adesione per microscopio</td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint</td></tr><tr><td>RIPA tampone&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>R0278-50ml</td><td>Isolamento proteico</td></tr><tr><td>Sutura di seta</td><td>Ethicon</td><td>VCP682G</td><td>4-0, 24 mm, taglio</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15596026</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr></tbody></table>

modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

L'occlusione tracheale fetale (TO), una modalità di trattamento consolidata, promuove la crescita polmonare fetale e la sopravvivenza in ernia diaframmatica congenita grave (CDH). Dopo TO, la ritenzione del liquido epiteliale secreto aumenta la pressione luminare e induce la crescita polmonare. Vari modelli animali sono stati definiti per comprendere la fisiopatologia di CDH e TO. Tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi come la difficoltà della tecnica, le dimensioni dell'animale, il costo, alti tassi di mortalità e la disponibilità di strumenti genetici. Qui viene descritto un nuovo modello transuterino di TO fetale murino. I topi gravidi venivano anestetizzati e l'utero esposto attraverso una laparotomia mediana. La trachea di feti selezionati era legata con una singola sutura transuterina posta dietro la trachea, un'arteria carotide e una vena giugulare. La diga è stata chiusa e ha permesso di riprendersi. I feti venivano raccolti poco prima del parto. Il rapporto tra peso polmonare e corpo nei feti TO era superiore a quello dei feti di controllo. Questo modello fornisce ai ricercatori un nuovo strumento per studiare l'impatto sia del TO che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.

Questo studio ha esaminato 37 feti: 20 (54,1%) rispetto ai 17 (45,9%) come controllo. Poiché la trachea non poteva essere occlusa in 4 feti nel gruppo TO, sono stati esclusi dallo studio. Non c'era alcuna differenza significativa nella mortalità in entrambi i gruppi: 4 feti (25%) nel gruppo TO e 2 feti (12%) nel gruppo di controllo (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, intervallo di confidenza del 95% (CI) 0,39-16,05). Il peso corporeo medio, il peso polmonare e il rapporto peso polmonare/corpor...

Vari modelli animali di ernia diaframmatica congenita e occlusione tracheale fetale presentano vantaggi e svantaggi per quanto riguarda questioni etiche, costi, difficoltà chirurgiche, dimensioni, tassi di sopravvivenza e disponibilità di strumenti genetici. Questo modello fornisce un nuovo strumento per studiare l'impatto sia dell'occlusione tracheale che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.

Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

I vantaggi più importanti di questa tecnica sono la reversibilità, la riduzione del costo degli animali e il mantenimento e un periodo di gravidanza più breve. Inoltre, la mortalità animale è ridotta perché non c'è bisogno di isterectomia. E ci sono più ampie opportunità di lavoro genetico.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la fisiopatologia dell'ernia diaframmatica congenita. Può anche essere applicato alla comprensione di altre malattie nel polmone, come mucche e ipoplasia polmonare. Inizia permettendo ai topi di accoppiarsi nella stessa gabbia dalle 18:00 alle 9:00 del giorno successivo.Per determinare E0, osservare la spina vaginale che ha una zona esterna omogenea attaccata alla parete vaginale e una zona interna fibrosa e includere alcuni spermatozoi che formano masse impigliate mescolate con le fibre del materiale della spina. Registrare il peso dei topi al momento dell'accoppiamento e sull'E10 per garantire una gravidanza in corso ed eseguire l'intervento chirurgico a E16.5. Sterilizzare gli strumenti che verranno utilizzati durante l'intervento chirurgico.Preriscaldare la piattaforma chirurgica a 24 gradi Celsius e preparare la salina calda prima dell'intervento chirurgico. Crea un ambiente caldo per il recupero e lascia il cibo umido all'interno della gabbia per l'alimentazione precoce. Pulire la superficie addominale con alcol e iodio povidone e mantenere condizioni sterili durante l'operazione.Eseguire un'incisione verticale per la laparotomia delle dighe gravide e tagliare tutti gli strati separatamente. Identificare le corna uterine su ciascun lato e determinare i feti candidati per l'intervento chirurgico. Operare su due feti in ogni corno uterino se c'è un numero pari di feti su ciascun lato.E su un feto in ogni corno uterino se c'è un numero dispari. Utilizzando occhiali di ingrandimento 2X per la visualizzazione, posizionare il corno uterino in modo trasversale. Posizionare i cuccioli rivolti verso l'alto tra due dita usando gli occhi e la coda come guida.Applicare una leggera pressione sulla testa del cucciolo per consentire l'estensione della testa e la visualizzazione del collo. Eseguire l'occlusione tracheale o TO utilizzando un ago atraumatico e una sutura in polipropilene 6 per 0. Tenere la placenta sul lato e lontano dai punti di ingresso e di uscita dell'ago.Inserire l'ago trasversalmente attraverso il lato dell'utero, lontano dalla placenta attraverso la parte anteriore di un terzo del collo. Quindi spostare delicatamente l'ago sulla linea mediana del collo. Dirigerlo verso la parte anteriore.Quindi uscire dal collo tra la trachea e di fronte alla focaia carotide e all'utero. Annodare la sutura, facendo attenzione a mantenere l'integrità delle membrane e della parete uterina. Sostituire il corno uterino nell'addome e iniettare due millilitri di soluzione salina sterile calda nella cavità peritoneale prima della chiusura.Posizionare una sutura di poliglactina 5 per 0 per chiudere la parete addominale. E chiudi la pelle con una sutura di seta non funzionante. Applicare 0,1 microgrammi per chilogrammo di buprenorfina intraperitonealmente per l'analgesia e lasciare che la diga si riprenda in un'incubatrice calda.Osserva che l'animale operato può nutrirsi da solo e tenerlo solo nella sua gabbia individuale. Raccogli tutti i feti entro l'E18.5 per sezione ceasarea e controlla la loro vitalità osservando i loro movimenti. Pesa tutti i feti.Eseguire un'incisione verticale sul torace per una toracotomia per sezionare i polmoni. E pesarli per calcolare il rapporto totale tra polmone e peso corporeo. Snap congela il tessuto in azoto liquido, composto ottimale della temperatura di taglio e ghiaccio secco.Tagliare i campioni in sezioni di 10 micrometri utilizzando un criostato e montarli su scivoli rivestiti in polilisina. Cuocere gli scivoli durante la notte a 60 gradi Celsius e macchiare gli scivoli al forno con ematossilina ed eosina. Immagine delle diapositive con ingrandimento da 10 a 20X, utilizzando un microscopio widefield.Per le analisi delle proteine e del DNA, agganciare il tessuto e omogeneizzarlo in 300 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione. Centrifuga a 18.000 x g e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi estrarre e quantificare proteine, DNA e RNA.Il peso corporeo medio, il peso polmonare e l'LBWR erano più alti nel gruppo TO che nel gruppo di controllo. Le quantità di DNA polmonare e il rapporto DNA/proteina erano più alti nel gruppo TO. Non è stata osservata alcuna differenza nell'RNA polmonare e le quantità di proteine erano inferiori nel gruppo TO rispetto al gruppo di controllo.Le analisi istologiche dei polmoni di controllo E18.5 hanno mostrato lo stadio sacculare tardivo o precoce dello sviluppo polmonare con lo sviluppo di spazi aerei e l'interstizio ispessito tra le superfici epiteliali. I polmoni del gruppo TO avevano spazi aerei centrali e distali dilatati con un numero soggettivamente più elevato di nuclei. Quando si tenta questo protocollo, fissiamo le suture in modo che gli occhi del feto siano visibili e il collo sia esteso in modo che l'ago non interrompa le strutture regolate.La rimozione delle strutture alla rinascita del feto nel ventilatore nitrile e nei modelli knockout di CDH saranno le future applicazioni di questa tecnica.

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Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli...

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi nel feto mouse. Il percorso di consegna è più efficiente in termini di orientamento dei polmoni fetali del mouse rispetto al comunemente usato intra-amniotico iniezione. Questa procedura deve momento non è stata descritta in un modello murino.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Questo video dimostra la procedura di occlusione tracheale transuterina di un feto di topo in un topo gravido. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'impatto della trachea occlusa sullo sviluppo polmonare.

Modellazione dell'occlusione tracheale fetale transuterina in modello murino: una procedura chirurgica per la legatura della trachea fetale all'interno di un topo gravido

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

Intubazione endotracheale in Mouse<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia diretta usando un otoscopio

Qui, presentiamo un protocollo di costrizione trasversale aortica (TAC) tramite un thoracotomy laterale. Questa tecnica è una procedura chirurgica mini-invasiva, chiuso il petto con l'obiettivo di simulare sovraccarico pressorio e insufficienza cardiaca nei topi utilizzando le impostazioni standard di Laboratorio TAC.

Un modello chiuso-cassa per indurre costrizione trasversale aortica in topi

Stenosi dell'innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell'impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l'impianto.

Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo raffinato di intubazione del topo di laboratorio. Il metodo non è invasivo e, quindi, ideale per studi che richiedono il monitoraggio seriale della funzione respiratoria e/o l'instillazione di trattamenti nel polmone.

Intubazione orotrachea ripetuta nei topi

Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l'ipossia.

Un modello murino di intubazione orotracheale e chirurgia ventilata di ischemia polmonare riperfusione

Il modello murino di trapianto tracheale intrapolmonare (IPTT) è utile per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree (OAD) dopo il trapianto di polmone. Offre approfondimenti sul comportamento immunologico e angiogenico polmonare specifico nell'obliterazione delle vie aeree dopo allotrapianto con elevata riproducibilità. Qui descriviamo la procedura IPTT e i suoi risultati attesi.

Trapianto tracheale intrapolmonare murino: un modello per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree dopo il trapianto di polmone

Scopri la tecnica di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi per studiare l'ernia diaframmatica congenita e lo sviluppo polmonare. Questo metodo reversibile riduce i costi e la mortalità animale.

Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi

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