Name: Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Impara a esprimere e purificare proteine di fusione IgG-GFP in Nicotiana benthamiana mediante cromatografia su colonna. Questo protocollo consente la visualizzazione delle proteine ricombinanti per applicazioni biotecnologiche e didattiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Maria Pia DiPalma per aver modificato il video. Ringraziamo anche l'Office of Educational Outreach and Student Services dell'Arizona State University per la loro generosa assistenza alle tasse di pubblicazione. La ricerca per questo protocollo è stata supportata dalla School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Coltivare n. piante di benthamiana 
<ol><li>Posizionare i pellet di torba del terreno su un vassoio e versare in precedenza bolliti, ancora caldi (~ 40-45 °C), acqua sui pellet di torba per una piena espansione. Dopo che i pellet sono stati completamente espansi, posizionare 2-3 N. semi di benthamiana su ogni pellet di torba utilizzando una pinzetta.</li>
	<li>Versare circa 0,5 in acqua per coprire il fondo del vassoio. Etichettare il vassoio con la data di semina. Continuare ad annaffiare le piantine ogni giorno con quantità appropriate di fertilizzante. La concentrazione di fertilizzanti (alimenti vegetali solubili in acqua per tutti gli scopi) è generalmente di 2,5-2,8 g/L.</li>
	<li>Coprire il vassoio con un piano umidioma quando posizionato nella camera di crescita. Conservare i pellet di torba seminati nella camera di crescita a 23-25 °C, con un fotoperiodo di 16 ore e un'umidità relativa del 60%.</li>
	<li>Dopo una settimana, rimuovere le piante extra lasciando ogni pellet con una sola piantina.</li>
	<li>Quando le piante hanno 2-3 settimane, trasferire ogni pellet di torba in una singola pentola contenente terreno di controllo dell'umidità. Questa dimostrazione ha utilizzato il terreno di invaso di controllo dell'umidità Miracle-Gro.</li>
	<li>Acqua al giorno con fertilizzante da 1 g/L. Non lasciare mai il terreno completamente asciutto. Le piante sono pronte per l'infiltrazione quando hanno 5-6 settimane.</li>
</ol>2. Preparazione di Agrobacterium tumefaciens per l'infiltrazione 
NOTA: I costrutti di fusione GFP-IgG possono essere ottenuti come descritto in questo documento31. Il gene asGFP è stato ottenuto e ottimizzato per le piante da questo studio45. I seguenti passaggi devono essere eseguiti accanto a un bruciatore Bunsen e devono essere applicate tecniche asettiche di base per evitare la contaminazione.
<ol><li>Streak A. tumefaciens EHA105 che ospita il virus della nana gialla dei fagioli (BeYDV)19 vettore di espressione delle piante per ogni costrutto (asGFP-IgG, GFP-IgG, catena leggera) da uno stock di glicerolo su agar LB (10 g/L Tripptone, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 15 g/L di agar, 50 μg/mL di kanamicina).</li>
	<li>Crescere per un giorno in un incubatore in piedi a 30 °C. Isolare una singola colonia per la verifica in base al protocollo PCR standard dello schermo colonia.</li>
	<li>Usa la colonia verificata per ogni costrutto. Riempire il tubo conico con 10 ml di mezzi LB (10 g/L di triptono, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 50 μg/mL). Aggiungere quindi 10 μL di 100 μg/mL di kanamicina. Aggiungere 10 μL di rifampicina da 2,5 μg/mL per evitare la contaminazione da E. coli. Incubare a 30°C e 120-150 giri/min durante la notte.</li>
	<li>Il giorno dopo, se la coltura di Agrobacterium viene coltivata a OD600 = 0,6-0,9, può essere utilizzata per l'infiltrazione. Se è ricoperto di vegetazione (OD600 > 1), 1-2 mL deve essere trasferito in LB fresco con antibiotici e coltivato all'OD600 richiesto. A seconda della concentrazione della coltura iniziale, potrebbero potenzialmente essere necessario due giorni per crescere fino a600 OD = 0,6-0,9.</li>
	<li>Una volta appropriato OD600, mettere le colture in una centrifuga e pelletare i batteri per centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti, temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Decanto supernatante da entrambi i campioni, quindi rimescolare ogni pellet in 1x tampone di infiltrazione (10 mM 2-(N-morpholino) acido etanolfonico, solfato di magnesio da 10 mM, regolato a pH 5,5 con KOH) per ottenere l'ODfinale 600 = 0,4. Questo dovrebbe richiedere circa 15-45 mL di tampone di infiltrazione, a seconda della densità iniziale della coltura. Combina volumi uguali di ogni costrutto di fusione IgG con il costrutto della catena di luce per ottenere l'ODfinale 600 = 0,2 per costrutto in ogni tubo.</li>
</ol>3. Agroinfiltrazione di siringhe senza ago
<ol><li>Prendi una graffetta raddrizzare e piante di N. benthamiana di 5-6 settimane dal passaggio 1. Utilizzando il bordo affilato della graffetta, fare una piccola puntura nel primo strato epidermico della foglia sulla superficie adassiale. Evita di forarla fino in fondo. NOTA: Le foglie inferiori sono più facili per l'infiltrazione, mentre le foglie sulla parte superiore della pianta sono più dure. Generalmente, l'espressione delle proteine ricombinanti è più alta nelle foglie situate nel mezzo di una pianta, e queste foglie divengono anche meno necrotiche.</li>
	<li>Riempire una siringa da 1 ml, senza un ago attaccato, con la soluzione agrobatterio preparata del passo 2. Coprire il foro fatto nel passaggio precedente con l'estremità della siringa e spingere lentamente per iniettare i batteri nella foglia mentre si applica una delicata contropressione da dietro la foglia. Guarda la foglia scurirsi mentre la soluzione viene iniettata senza applicare troppa pressione sulla siringa.</li>
	<li>Cerca di infiltrarti nella maggior parte dell'area fogliare a un massimo di 3-4 volte: un danno eccessivo alle foglie può ostacolare la resa proteica. La foglia vegetale infiltrata apparirà per lo più scura dalla vista inferiore. NOTA: Questa soluzione batterica dovrebbe essere sufficiente per almeno 3-4 piante per costrutto. Autoclavare qualsiasi soluzione batterica rimanente prima di scartare.</li>
</ol>4. Crescere e osservare l'infiltrato N. benthamiana 
<ol><li>Riposizionare le piante infiltrate nella camera di crescita e continuare ad annaffiare ogni giorno.</li>
	<li>Osservare le foglie per la clorosi e la necrosi nelle aree infiltrate. Osservare le piante per la fluorescenza GFP (se gfp è presente) sotto una lampada UV a onde lunghe e corte.</li>
	<li>Il giorno 4-5 mostra la più alta fluorescenza di entrambi i costrutti GFP nelle foglie. Raccogliere tutte le foglie a 4-5 dpi (giorni post-infiltrazione) e pesare il materiale fogliare totale.</li>
	<li>Utilizzarlo immediatamente per la lavorazione a valle o conservare a -80 °C fino a quando non è pronto per l'uso.</li>
</ol>5. Estrazione di proteine
<ol><li>Conservare tamponi e tazze di frullatore sul ghiaccio o a 4 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 2-3 mL di tampone di estrazione ghiaccio-freddo (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 con HCl) per 1 g di materiale vegetale. Aggiungere 2 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF) dallo stock (100 mM) e 50 mM di ascorbato di sodio al tampone di estrazione poco prima dell'estrazione.</li>
	<li>Posizionare il tessuto vegetale dal passaggio 4 nella tazza del frullatore prechilled. Aggiungere una quantità misurata di tampone di estrazione refrigerato alla tazza del frullatore (come indicato al passaggio 5.2). Posizionare la tazza del frullatore sul frullatore. Prendi un foglio di parafilm pretagliato e allungalo sopra la parte superiore della tazza del frullatore. Frullare all'omogeneità con intervalli di 20 secondi, mescolando bene tra i cicli di miscelazione in base alle esigenze.</li>
	<li>Trasferire il materiale miscelato in un becher. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare a 4 °C per 30 min per migliorare la solubilità proteica e consentire la precipitazione dei solidi.</li>
	<li>Posizionare 2 strati di Miracloth su un becher pulito sul ghiaccio e versare l'estratto attraverso di esso per rimuovere grandi detriti fogliari. Dopo aver versato tutto l'estratto, piegare il Miracloth per spremere l'estratto residuo delle foglie. L'estratto dovrebbe apparire verde scuro senza particelle visibili.</li>
	<li>Trasferire 50 μL di questo campione su un nuovo tubo da 1,5 ml ed etichettare "estratto totale" per un'analisi successiva. Trasferire l'estratto in tubi di centrifuga. Centrifugare il resto dell'estratto vegetale a 16.000 x g per 20 min, 4 °C e trasferire il supernatante in un tubo conico.</li>
	<li>Filtrare l'estratto solubile utilizzando una siringa da 50 ml e un filtro in fibra di vetro per siringhe (0,75 μm).</li>
	<li>Raccogliere 50 μL di un campione dopo la centrifugazione, etichettare "estratto solubile" per un'analisi successiva.</li>
</ol>6. Procedura di cromatografia della colonna G proteica
NOTA: Il protocollo qui descritto è per la cromatografia a flusso gravitazionale utilizzando la resina di agarosio Pierce Protein G. Se si utilizza una resina diversa, fare riferimento alle istruzioni del produttore per le regolazioni. Non lasciare mai asciugare la resina e impedire che tutto il liquido si scarichi. Riacquisiamo l'uscita in base alle esigenze.
<ol><li>Impostare una colonna di polipropilene contenente 20 mL di campione.</li>
	<li>Stimare la quantità di liquami necessari a seconda del tipo di immunoglobulina bersaglio e della sua affinità con la resina. Generalmente, 3 mL di liquame totale con volume del letto di 1,5 mL sono sufficienti per la purificazione di diversi milligrammi di Ab.</li>
	<li>Versare con cura la quantità richiesta di liquami rimorsi nella colonna limitata. Aprire la presa di colonna dalla parte inferiore della colonna e lasciare che si scarichi fino a quando la maggior parte del buffer non è sparita.</li>
	<li>Versare immediatamente 10 mL di tampone di lavaggio 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 con HCl) in cima. Lasciare scolare e ripetere questo passaggio di lavaggio 2x.</li>
	<li>Applicare il campione filtrato dal passaggio 5 alla colonna e raccogliere il flusso- aliquota 50 μL di flusso per un'analisi successiva. Salvare il resto del flusso nel caso in cui l'Ab non si sia legato alla resina. NOTA: la riapplicazione del flusso a una nuova colonna di solito non si traducono in una buona resa; quindi si consiglia di iniziare con nuovo materiale fogliare.</li>
	<li>Lavare la resina due volte con 10 mL di 1x PBS per ridurre la legatura non specifica. Se lo si desidera, aliquota 50 μL di lavaggio mentre il tampone scorre attraverso la colonna per verificare che il target Ab non sia eluitato con un tampone di lavaggio.</li>
	<li>Impostare ed etichettare cinque tubi con 125 μL di Tris-HCl sterile da 1 M a pH 8. Questo per neutralizzare gli Abs nel tampone di eluizione acida per evitare potenziali cambiamenti strutturali. In alternativa, aggiungere 30 μL di base Tris da 2 M per ottenere un campione meno diluito. ATTENZIONE: Durante l'eluizione, la luce UV può essere utilizzata per la visualizzazione. Ciò non deve essere fatto per tutta la durata dell'eluizione. Se si utilizza l'UV, assicurarsi di indossare DPI appropriati per evitare danni agli occhi e alla pelle. Non è necessario utilizzare una luce UV durante la fase di eluizione.</li>
	<li>Elute gli Abs applicando 5 ml di tampone di eluizione (glicina da 100 mM, pH 2,5 con HCl) alla colonna e raccogliere 1 mL di frazioni a ciascun tubo designato dal passo precedente.</li>
	<li>Rigenerare immediatamente la colonna applicando 20 mL di tampone di lavaggio, seguiti da 10 mL di tampone di lavaggio. Assicurarsi che la resina non sia lasciata in un ambiente acido per un lungo periodo di tempo. Le eluizioni dovrebbero apparire fluorescenti, spesso la fluorescenza più alta è vista nella seconda eluizione ma può variare dall'estrazione all'estrazione.</li>
	<li>Per lo stoccaggio, lavare la resina con 10 mL di 20% di etanolo in PBS e lasciarla drenare a metà strada. Riacquisire la parte superiore, quindi la parte inferiore della colonna, e mantenere in posizione verticale a 4 °C. NOTA: Generalmente, le resine proteiche G possono essere riutilizzate fino a 10 volte senza una significativa perdita di efficienza. Fare riferimento alle linee guida del produttore per dettagli specifici.</li>
	<li>Determinare la concentrazione ab utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 280 nm, utilizzando il buffer di eluizione come vuoto. Conservare gli eluati in -80 °C e aliquota 50 μL di ogni frazione in un tubo separato per ulteriori analisi.</li>
</ol>7. SDS-PAGE per il rilevamento della fusione GFP-Ig
<ol><li>Preparare tutti gli esempi prima di configurare SDS-PAGE.<ol>
<li>Aggiungere 4 μL di tampone del campione (6x tampone di campione riducente: 3,0 mL di glicerolo, 0,93 g di DTT, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo); (6x tampone campione non riducente: 3,0 mL di glicerolo, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo) a 20 μL di ciascun campione (estratto totale, estratto solubile, flusso, lavaggio, tutte le frazioni di eluizione) per l'analisi. Assicurarsi che i tappi dei tubi siano fissati saldamente.</li>
		<li>Trattare solo riducendo i campioni per 5 minuti in un bagno d'acqua bollente, quindi mettere campioni per 5 minuti sul ghiaccio. Spin campioni in un microcentrifugo per ~5 s e caricare 20 μL di ciascun campione nell'ordine di raccolta nei pozzi di gel. Caricare 3 μL di scala proteica a doppio colore in un pozzo separato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire il gel SDS-PAGE a una separazione costante da 100 V a banda proteica desiderata; ci vogliono circa 1,5 ore. Monitorare la scala come indicatore di separazione proteica.</li>
	<li>Visualizza il gel sotto l'UV per osservare la fluorescenza GFP.</li>
	<li>Se lo si desidera, macchiare il gel con la macchia di Coomassie per valutare la proteina totale in ogni campione. In alternativa, eseguire western blot per valutare le proteine bersaglio utilizzando abs specifici. NOTA: Sia la colorazione Coomassie che la macchia occidentale possono essere eseguite seguendo i protocolli standard47,48.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo può essere utilizzato per la verifica visiva di qualsiasi ab ricombinante o proteina ricombinante prodotta nelle piante di N. benthamiana, comprese quelle che richiedono un'esposizione temporanea ad ambienti acidi ai fini della purificazione dellecolonne 42,43,44. Inoltre, la fusione di asGFP con altre proteine in diversi sistemi di espressione può essere uno strumento utile per la visualizzazione sper...

I rapporti dell'industria indicano che tredici dei venti farmaci più incassi negli Stati Uniti erano biologici (prodotti farmaceutici a base proteica), di cui nove erano anticorpi. A dicembre 2019, c'erano oltre 570 terapie anticorpali (Ab) in varie fasi di sviluppoclinico 1,2,3. Le attuali vendite globali di Ab superano i 100 miliardi di dollari e il mercato terapeutico monoclonale Ab (mAb) dovrebbe generare fino a 300 miliardi di DOLLARI entro il 20251,4. Con una domanda così elevata e aumenti previsti delle entrate, i ricercatori hanno lavorato per sviluppare modi per produrre terapie Ab su scala sempre più ampia, con una qualità più elevata e costi inferiori. I sistemi di espressione a base vegetale hanno diversi vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari di mammiferi per la produzione economica e su larga scala di terapie Ab5,6. La produzione di terapie proteiche nelle piante ("pharming molecolare") non richiede costosi bioreattori o strutture di coltura cellulare, così come le tecniche tradizionali di coltura cellulare dei mammiferi7,8. Le piante non possono contrarre agenti patogeni umani, riducendo al minimo la potenzialecontaminazione 9. Sia l'espressione proteica transiente che transgenica a base vegetale può essere utilizzata come alternativa a basso costo ai sistemi di produzione di mammiferi o batteri10. Sebbene le piante transgeniche siano preferite per la produzione vegetale, la produzione di proteine ricombinanti utilizzando questo metodo può richiedere da settimane a mesi. I progressi nell'espressione transitoria utilizzando vettori virali attraverso siringa o agroinfiltrazione sottovuoto consentono, rispettivamente, la produzione su piccola e grande scala della proteina desiderata neigiorni 11,12,13,14. La produzione di mAb contro Ebola, Dengue e, Zika, e numerose altre proteine ricombinanti, sono stati prodotti e purificati in modo rapido ed efficiente utilizzando l'espressione transitoria negli impianti N. benthamiana 15,16,17,18,19. Queste circostanze rendono l'espressione transitoria a base vegetale un'opzione interessante per lo sviluppo di più terapie Ab e dei metodi dimostrati in questo protocollo20.
I mAb di prima generazione erano di derivazione murina, il che ha portato a immunogenicità non specifica se utilizzati in studi sull'uomo21. Nel corso del tempo, gli Abs chimerici, umanizzati e, infine, completamente umani sono stati prodotti per ridurre l'immunogenicità indotta dalle terapie Ab. Sfortunatamente, alcuni di questi Abs causano ancora immunogenicità dell'ospite a causa delle differenze nella glicosilazione21. Gli sviluppi nell'ingegneria impiantistica hanno permesso la modifica degli glicani ab, che è essenziale poiché la stabilità e la funzione di ab possono essere significativamente influenzate dal suo stato di glicosilazione22. I progressi hanno permesso la produzione in sistemi vegetali di espressione di alto livello di mAb umanizzati, contenenti glicani umani e di conseguenza i tratti biologici desiderati di un farmaco umano prodotto inserie 19,21.
Oltre agli Abs ricombinanti, le molecole di fusione Ab (fusioni Ab) sono state esplorate per vari scopi negli ultimi decenni. Le fusioni ab spesso consistono in un frammento ab o ab fuso a una molecola o proteina e sono progettate per suscitare risposte dalle cellule dell'effettore immunitario23. Queste molecole sono state create come potenziali interventi terapeutici per trattare varie patologie come il cancro e le malattie autoimmuni24,25,26,27. I complessi immunitari ricombinanti (RIC) sono un'altra classe di fusioni Ab che sono state impiegate come candidati al vaccino28. I RIC sfruttano la capacità del sistema immunitario di riconoscere le regioni Fc delle fusioni Ab e sono stati trovati per migliorare l'immunogenicità se combinati con altre piattaformevaccinali 29,30,31.
La proteina fluorescente verde (GFP) è una proteina bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea Victoria, che emette luce verde quando eccitata dalla luceultravioletta 32,33. Nel corso degli anni, l'uso della GFP come marcatore visivo dell'espressione genica si è esteso dall'espressione in Escherichia coli a numerosi sistemi di espressione proteica, tra cui le piante di N. benthamiana 34,35,36,37,38. I marcatori visibili, come la FPG, hanno abbondanti implicazioni nell'insegnamento e nell'apprendimento di concetti scientifici. Numerosi studenti entry-level descrivono difficoltà a cogliere concetti scientifici quando l'idea insegnata non è visibile ad occhio nudo, come i concetti di biologia molecolare e campi correlati39. I marcatori visivi, come la GFP, possono così contribuire all'elaborazione delle informazioni relative ai processi scientifici e potrebbero contribuire a ridurre le difficoltà che gli studenti segnalano nell'apprendimento di numerosi concetti scientifici.
Sebbene la GFP sia spesso usata come marcatore per indicareil gene e l'espressione in vivo , è difficile visualizzarlo nei processi a valle se si utilizzano condizioni acide. Questa circostanza è principalmente perché GFP non mantiene la sua struttura e la fluorescenza risultante a un basso pH40. Gli ambienti acidi temporanei sono spesso richiesti in vari processi di purificazione, come la proteina G, la proteina A e la cromatografia proteina L, spesso utilizzate per la purificazione Ab41,42,43,44. I mutanti GFP sono stati utilizzati per trattenere la fluorescenza in condizioniacide 45,46.
Nel presente documento descriviamo un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione delle proteine di fusione IgG ricombinanti nelle piante di N. benthamiana. Abbiamo prodotto la GFP tradizionale fusa all'N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione GFP-IgG. Contemporaneamente, abbiamo sviluppato la fusione di una sequenza ottimizzata per il codone vegetale per una GFP acido-stabile (asGFP) al N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione asGFP-IgG. I vantaggi della produzione di GFP-IgG includono la capacità di visualizzare la presenza di una proteina bersaglio durante l'espressione, mentre asGFP-IgG consente di vedere la presenza di proteine ricombinanti non solo nelle fasi di espressione ed estrazione ma anche nelle fasi di purificazione della proteina. Questo protocollo può essere adattato per la produzione, la purificazione e la visualizzazione di una gamma di proteine di fusione GFP prodotte in N. benthamiana e purificate utilizzando tecniche di cromatografia che richiedono un basso pH. Il processo può anche essere adattato a varie quantità di materiale fogliare. Mentre l'Abs e le proteine di fusione contrassegnate con GFP o asGFP non sono destinate ad essere utilizzate per le terapie, questi metodi possono essere utili come controlli durante gli esperimenti e possono anche essere ulteriormente utilizzati come strumento di insegnamento per la biologia molecolare e cellulare e la biotecnologia, sia di persona che virtualmente.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 5 mL</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 mL</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Frullatore con tazze</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiotreitolo)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ( Acido etilendinitrilo)tetraacetico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Acido cloridrico)</td><td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>qualsiasi fornitore rispettabile</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 con pellet di torba</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (cloruro di potassio)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (fosfato di potassio)</td><td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (idrossido di potassio)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Miscela per il controllo dell'umidità</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Fosfato di sodio)</td><td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (cloruro di sodio)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Semi di nicotiana benthamiana</td><td>qualsiasi fornitore rispettabile</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro)</td><td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Colonna in polipropilene</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Resina di proteina G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td> <td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>qualsiasi fornitore rispettabile</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0,75 & micro; m filtro in fibra di vetro</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per pellet di torba con cupola</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>qualsiasi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solubile in acqua per tutti gli usi Alimento Vegetale</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di proteine di fusione igg espresse transitoriamente in nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

L'elevata domanda di anticorpi come interventi terapeutici per varie malattie infettive, metaboliche, autoimmuni, neoplastiche e altre malattie crea una crescente necessità nello sviluppo di metodi efficienti per la produzione di anticorpi ricombinanti. A dicembre 2019, c'erano più di 70 anticorpi monoclonali approvati dalla FDA e c'è un potenziale di crescita esponenziale. Nonostante la loro promessa, i fattori limitanti per un uso diffuso sono i costi di produzione e la complessità. Potenzialmente, le piante offrono strategie di produzione proteica a basso costo, sicure e facilmente scalabili. Piante come Nicotiana benthamiana non solo possono piegare e assemblare correttamente proteine mammifere complesse, ma possono anche aggiungere modifiche critiche post-tras traslazione simili a quelle offerte dalle colture cellulari dei mammiferi. In questo lavoro, utilizzando la GFP nativa e una variante stabile all'acido della proteina fluorescente verde (GFP) fusa agli anticorpi monoclonali umani, siamo stati in grado di visualizzare l'intera espressione anticorpale transitoria e il processo di purificazione dalle piante di N. benthamiana. A seconda dello scopo dell'esperimento, la fusione GFP nativa può garantire una visualizzazione più semplice durante la fase di espressione nelle piante, mentre la fusione GFP stabile all'acido consente la visualizzazione durante l'elaborazione a valle. Questa procedura scalabile e diretta può essere eseguita da un singolo ricercatore per produrre quantità di milligrammo di anticorpi altamente puri o proteine di fusione anticorpale in pochi giorni utilizzando solo poche piccole piante. Tale tecnica può essere estesa alla visualizzazione di qualsiasi tipo di processo di purificazione degli anticorpi e potenzialmente di molte altre proteine, sia nei sistemi vegetali che in altri sistemi di espressione. Inoltre, queste tecniche possono beneficiare di istruzioni virtuali ed essere eseguite in un laboratorio didattico da studenti universitari in possesso di una minima esperienza precedente con tecniche di biologia molecolare, fornendo una base per l'esplorazione basata su progetti con applicazioni del mondo reale.

Questo studio dimostra un metodo facile e veloce per produrre proteine ricombinanti e visualizzarle durante i processi a valle. Utilizzando N. benthamiana e seguendo il protocollo fornito, la produzione di proteine ricombinanti qui descritta può essere raggiunta in meno di una settimana. Il flusso di lavoro complessivo dell'espressione, dell'estrazione e della purificazione dell'impianto è illustrato nella figura 1. Le fasi di crescita delle piante delle piantine di 2 settimane, del...

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Questa è una dimostrazione di un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso con GFP nelle piante di Nicotiana benthamiana legate al tabacco. Questo protocollo può essere utilizzato per la purificazione e la visualizzazione di anticorpi prodotti dalle piante, fusioni di anticorpi e la maggior parte delle proteine che possono essere purificate attraverso la cromatografia delle colonne. Questo protocollo consente ai ricercatori e agli studenti dei laboratori universitari di visualizzare le proteine taggate GFP nella maggior parte delle fasi del processo di produzione delle proteine.Posizionare i pellet di torba del terreno su un vassoio e versare acqua precedentemente bollita e ancora calda sopra i pellet di torba per una piena espansione. I pellet richiederanno alcuni minuti per espandersi completamente. Dopo che i pallet sono stati completamente espansi, posizionare da due a tre semi di Nicotiana benthamiana su ogni pellet di torba utilizzando una pinzetta.Dopo aver fatto questo, dovrai versare circa 0,5 pollici di acqua per coprire il fondo del vassoio. Non dimenticare di etichettare il vassoio con la data di semina. Continua

production-igg-fusion-proteins-transiently-expressed-nicotiana

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Impara a esprimere e purificare proteine di fusione IgG-GFP in Nicotiana benthamiana mediante cromatografia su colonna. Questo protocollo consente la visualizzazione delle proteine ricombinanti per applicazioni biotecnologiche e didattiche.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Esplora altri video