Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Questa tecnica consentirà ai ricercatori di isolare le cellule staminali del cancro al seno alla massima purezza e vitalità per l'esecuzione di saggi di caratterizzazione funzionale sia in vitro che in vivo. Le cellule staminali isolate del cancro al seno possono anche essere utilizzate per aiutare a chiarire gli eventi molecolari che controllano la tumorigenicità e le metastasi e per progettare strategie terapeutiche per colpire queste cellule. Con piccole modifiche specifiche per i tipi di cellule e tessuti di interesse, questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi.

Per generare una sospensione di una singola cellula da una coltura cellulare, lavare una coltura cellulare di carcinoma mammario confluente all'80% con PBS e trattare le cellule con una soluzione di dissociazione cellulare appropriata per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la soluzione di dissociazione cellulare e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS per il conteggio.

Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule, quindi risospendere le cellule in una sola volta da 10 a 6 cellule per millilitro di tampone substrato ALDH. Per generare una sospensione di una singola cellula da un campione di tessuto, utilizzare lame chirurgiche con tecnica incrociata per tritare il tessuto tumorale in pezzi di circa un millimetro. Mettere i pezzi in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di tampone di dissociazione.

Sigillare la provetta con parafilm per un'incubazione di 40 minuti a 37 gradi Celsius in un agitatore e sedimentare i pezzi di tessuto digerito mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di tripsina utilizzando una pipetta da cinque millilitri e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, pipettare energicamente il tessuto più volte per rilasciare singole cellule e aggiungere una quantità sufficiente di terreno DMEM/F-12 per portare il volume totale nella provetta a 25 millilitri.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere il pellet in un millilitro di Displace DNAse e incubare per cinque minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, portare il volume totale a 10 millilitri con PBS. Mescolare le cellule mediante pipettaggio e farle passare attraverso un colino da 40 micron in una provetta da 50 millilitri.

Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS fresco per il conteggio. Per eseguire un saggio di formazione di colonie, dopo lo smistamento, risospendere le cellule in terreno completo e aggiungere il numero appropriato di cellule staminali del cancro al seno a ciascuna delle tre provette contenenti due millilitri di terreno per provetta, etichettate una volta 10 al secondo, due volte 10 al secondo o cinque volte 10 al secondo cellulare. Pipettare su e giù cinque volte per miscelare accuratamente la sospensione cellulare e piastrarle in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti.

Agitare delicatamente la piastra per ottenere distribuzioni cellulari uniformi e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari fino alla comparsa delle colonie. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzetto e colorare le cellule con 500 microlitri di soluzione di cristallovioletto allo 0,05% per pozzetto per 30 secondi. Al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti due volte con due millilitri di acqua per pozzetto per rimuovere il colorante in eccesso, e contare e registrare il numero totale di colonie per pozzetto mediante microscopia ottica con un ingrandimento di quattro o 10 volte.

Per eseguire un saggio della mammosfera, dopo lo smistamento, risospendere le cellule in un mezzo di mammosfera completo e piastrelle a una densità di seduta di cinque volte 10 delle seconde cellule per centimetro quadrato di area per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti a bassissimo attacco. Prima di contare il numero di mammosfere per pozzetto mediante microscopia ottica, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per cinque-10 giorni. Per impostare un modello di coltura 3D, aggiungere con cura 50 microlitri di estratto di membrana basale a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti senza bolle e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire alla soluzione di polimerizzare.

Aggiungere 100 microlitri di PBS dopo 10 minuti per evitare che lo strato di gel si secchi. Al termine dell'incubazione, sospendere le cellule selezionate da cinque a 50 volte da 10 a terze cellule per 200 microlitri di concentrazione di terreno di coltura 3D e sostituire il PBS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 200 microlitri di terreno contenente cellule. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 10-14 giorni prima di valutare le colture per la formazione di organoidi.

Le cellule di carcinoma mammario umano che mostrano una maggiore attività enzimatica di ALDH esprimono alti livelli di CD44 e livelli bassi o negativi di espressione di CD24 e possono essere classificate come cellule staminali di cancro al seno. La percentuale di cellule staminali del cancro al seno all'interno della popolazione di massa può variare tra le linee cellulari o i pazienti e spesso dipende dallo stadio della malattia, con il cancro al seno più aggressivo che mostra in genere una percentuale più elevata di cellule staminali del cancro al seno. La capacità di una singola cellula di cancro al seno di autorinnovarsi e generare colonie di 50 cellule può essere valutata mediante saggi di formazione di colonie.

La capacità delle cellule staminali del cancro al seno di autorinnovarsi in condizioni sperimentali indipendenti dall'ancoraggio può essere valutata mediante saggi della mammosfera. La coltura delle cellule del cancro al seno e dell'estratto della membrana basale consente alle cellule staminali del cancro al seno di formare strutture 3D che ricapitolano le condizioni in vivo. Inoltre, i modelli di xenotrapianto murino in vivo possono essere utilizzati per comprendere le differenze nella crescita, nell'auto-rinnovo, nella differenziazione e/o nella capacità di iniziare il tumore delle cellule staminali del cancro al seno rispetto alle cellule staminali non del cancro al seno o alle popolazioni di cellule di massa.

Seguendo questa procedura, le cellule staminali isolate del cancro al seno possono essere utilizzate in studi trascrittomici, cinematici e metabolomici. Questo metodo offre ai ricercatori l'opportunità di esplorare il ruolo delle cellule staminali del cancro al seno nell'inizio del tumore, nelle metastasi, nella recidiva e nella resistenza alla terapia.