Name: Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule staminali del cancro al seno da campioni cellulari e tissutali con elevata purezza e vitalità. Questo metodo consente saggi funzionali in vitro e in vivo per studiare tumorigenesi e metastasi.

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Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per le loro utili discussioni e supporto. La nostra ricerca sulle cellule staminali del cancro al seno e sul microambiente tumorale è finanziata da sovvenzioni del Canadian Cancer Research Society Research Institute e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti Breast Cancer Program (Grant # BC160912). V.B. è supportato da una Western Postdoctoral Fellowship (Western University), e sia A.L.A. che V.B. sono supportati dalla Breast Cancer Society of Canada. C.L. è supportato da una borsa di studio Vanier Canada Graduate dal governo del Canada.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le metastasi del cancro al seno e la resistenza alla terapia sono diventate la principale causa di mortalità nelle donne di tutto il mondo. L'esistenza di una sottopopolazione di cellule staminali del cancro al seno (BCSC) contribuisce all'aumento delle metastasi 26,43,44,45,46 e alla resistenza alla terapia21,47,48.<sup clas...

Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari delle cellule staminali del cancro al seno umano (BCSC) è fondamentale per affrontare le sfide incontrate nel trattamento del cancro al seno. L'emergere del concetto BCSC risale all'inizio del 21° secolo, dove una piccola popolazione di cellule CD44 + CD24-/basso cancro al seno sono state trovate in grado di generare tumori eterogenei nei topi 1,2. Successivamente, è stato osservato che le cellule di cancro al seno umano con elevata attività enzimatica dell'aldeide deidrogenasi (ALDHalto) mostravano anche proprietà simili alle cellule staminali3. Questi BCSCs rappresentano una piccola popolazione di cellule capaci di auto-rinnovamento e differenziazione, contribuendo alla natura eterogenea dei tumori bulk 1,2,3. Prove crescenti suggeriscono che alterazioni nelle vie di segnalazione evolutivamente conservate guidano la sopravvivenza e il mantenimento del BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Inoltre, il microambiente estrinseco cellulare ha dimostrato di svolgere un ruolo fondamentale nel dettare diverse funzioni BCSC15,16,17. Queste vie molecolari e i fattori esterni che regolano la funzione del BCSC contribuiscono alla recidiva del cancro al seno, alle metastasi18 e allo sviluppo di resistenza alle terapie 19,20,21, con l'esistenza residua di BCSC post-trattamento che rappresenta una sfida importante per la sopravvivenza globale delle pazienti con carcinoma mammario22,23 . La valutazione pre-clinica di questi fattori è quindi molto importante per identificare le terapie mirate al BCSC che potrebbero essere utili per ottenere migliori risultati di trattamento e una migliore sopravvivenza globale nei pazienti con cancro al seno.
Diversi modelli in vitro di linee cellulari di carcinoma mammario umano e modelli di xenotrapianto umano in vivo sono stati utilizzati per caratterizzare BCSCs 24,25,26,27,28,29. La capacità delle linee cellulari di ripopolarsi continuamente dopo ogni passaggio successivo rende questi un sistema modello ideale per eseguire studi omici e farmacogenomici. Tuttavia, le linee cellulari spesso non riescono a ricapitolare l'eterogeneità osservata nei campioni di pazienti. Pertanto, è importante integrare i dati delle linee cellulari con campioni derivati dal paziente. L'isolamento dei BCSC nella loro forma più pura è importante per consentire una caratterizzazione dettagliata dei BCSC. Il raggiungimento di questa purezza dipende dalla selezione di marcatori fenotipici specifici per i BCSC. Attualmente, il fenotipo cellulareALDH ad altocontenuto di CD44 + CD24- è più comunemente usato per distinguere e isolare i BCSC umani da popolazioni di cellule di cancro al seno di massa utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per la massima purezza1, 3,26. Inoltre, le proprietà di BCSC isolati come l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione possono essere valutate utilizzando tecniche in vitro e in vivo.
Ad esempio, i saggi in vitro per la formazione di colonie possono essere utilizzati per valutare la capacità di una singola cellula di auto-rinnovarsi per formare una colonia di 50 cellule o più in presenza di diverse condizioni di trattamento30. I saggi della mammosfera possono anche essere utilizzati per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule del cancro al seno in condizioni indipendenti dall'ancoraggio. Questo test misura la capacità delle singole cellule di generare e crescere come sfere (miscela di BCSC e non BCSC) ad ogni passaggio successivo in condizioni di coltura non aderenti prive di siero31. Inoltre, i modelli di coltura tridimensionale (3D) possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC, comprese le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che ricapitolano da vicino il microambiente in vivo e consentono di studiare l'attività di potenziali terapie mirate al BCSC32. Nonostante le diverse applicazioni dei modelli in vitro, è difficile modellare la complessità delle condizioni in vivo utilizzando solo saggi in vitro. Questa sfida può essere superata utilizzando modelli di xenotrapianto murino per valutare il comportamento BCSC in vivo. In particolare, tali modelli servono come sistema ideale per valutare le metastasi del cancro al seno 33, studiare le interazioni con il microambiente durante la progressione della malattia 34, l'imaging in vivo 35 e per prevedere la tossicità e l'efficacia specifiche del paziente degli agenti antitumorali 34.
Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata per l'isolamento di BCSC umani ALDHad altocontenuto di CD44+CD24- alla massima purezza da popolazioni massicce di cellule eterogenee di carcinoma mammario. Forniamo anche una descrizione dettagliata di tre tecniche in vitro (saggio di formazione di colonie, saggio della mammosfera e modello di coltura 3D) e un saggio di xenotrapianto tumorale in vivo che può essere utilizzato per valutare diverse funzioni dei BCSC. Questi metodi sarebbero appropriati per l'uso da parte di ricercatori interessati a isolare e caratterizzare i BCSC da linee cellulari di carcinoma mammario umano o cellule di cancro al seno derivate da pazienti primari e tessuto tumorale ai fini della comprensione della biologia BCSC e / o dello studio di nuove terapie mirate al BCSC.

<table><tbody><tr><td>7-amminoattinomicina D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>consigliato: 0,25 &micro; g/1x106 cellule</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di aldeide deidrogenasi (ALDH)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Venduto commercialmente come parte del kit di analisi ALDEFLOUR; seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del substrato ALDH</td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Venduto con il nome commerciale Matrigel</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari: 6 pozzetti</td><td></td><td>Corning 877218</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari: 60 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari: 96 pozzetti a bassissimo attacco</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare: 40 micron</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Preparare una diluizione 1:30 di 3 mg/mL di collagene in PBS</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>Provette coniche: 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Cristallovioletto</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Utilizzare una soluzione di cristallovioletto allo 0,05% in acqua per la colorazione</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, con L-glutammina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0,1 mg/mL concentrazione finale</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&nbsp; Tubi </td></tr><tr><td>flow: 5 ml</td><td>di tubi BD</td><td>352063</td><td>polipropilene a fondo tondo</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD24 di topo</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-ficoeritrina e colorante cianina coniugato Clone: ML5</td></tr><tr><td>anticorpo CD44 di topo</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-ficoeritrina coniugata, Clone: G44-26</td></tr><tr><td>N, N-dietilamminobenzaldeide (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Venduto commercialmente come parte del kit di analisi ALDEFLOUR; seguire le istruzioni del produttore Preparazione DEAB</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media Composizione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Con L-glutammina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Organoid Media Composizione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Con L-glutammina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulina &beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro; M</td></tr></tbody></table>

isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Le cellule staminali del cancro al seno (BCSC) sono cellule tumorali con caratteristiche simili alle cellule staminali ereditarie o acquisite. Nonostante la loro bassa frequenza, sono i principali contributori all'inizio del cancro al seno, alla recidiva, alle metastasi e alla resistenza alla terapia. È imperativo comprendere la biologia delle cellule staminali del cancro al seno al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del cancro al seno. Le cellule staminali del cancro al seno sono isolate e caratterizzate sulla base dell'espressione di marcatori di superficie cellulare unici come CD44, CD24 e dell'attività enzimatica dell'aldeide deidrogenasi (ALDH). Queste celluleALDH ad altocontenuto di CD44+CD24- costituiscono la popolazione BCSC e possono essere isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per studi funzionali a valle. A seconda della domanda scientifica, possono essere utilizzati diversi metodi in vitro e in vivo per valutare le caratteristiche funzionali dei BCSC. Qui, forniamo un protocollo sperimentale dettagliato per l'isolamento di BCSC umani sia da popolazioni eterogenee di cellule di cancro al seno che da tessuto tumorale primario ottenuto da pazienti con cancro al seno. Inoltre, evidenziamo saggi funzionali a valle in vitro e in vivo , tra cui saggi di formazione di colonie, saggi di mammosfera, modelli di coltura 3D e saggi di xenotrapianto tumorale che possono essere utilizzati per valutare la funzione BCSC.

Il protocollo descritto consente l'isolamento di BCSC umani da una popolazione eterogenea di cellule di cancro al seno, sia da linee cellulari che da tessuto tumorale dissociato. Per ogni data linea cellulare o campione di tessuto, è fondamentale generare una sospensione monocellulare uniforme per isolare i BCSC alla massima purezza poiché la contaminazione delle popolazioni non-BCSC potrebbe comportare risposte cellulari variabili, specialmente se lo scopo dello studio è valutare l'efficacia degli agenti terapeutici mir...

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Questa tecnica consentirà ai ricercatori di isolare le cellule staminali del cancro al seno alla massima purezza e vitalità per l'esecuzione di saggi di caratterizzazione funzionale sia in vitro che in vivo. Le cellule staminali isolate del cancro al seno possono anche essere utilizzate per aiutare a chiarire gli eventi molecolari che controllano la tumorigenicità e le metastasi e per progettare strategie terapeutiche per colpire queste cellule. Con piccole modifiche specifiche per i tipi di cellule e tessuti di interesse, questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi.Per generare una sospensione di una singola cellula da una coltura cellulare, lavare una coltura cellulare di carcinoma mammario confluente all'80% con PBS e trattare le cellule con una soluzione di dissociazione cellulare appropriata per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la soluzione di dissociazione cellulare e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS per il conteggio.Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule, quindi risospendere le cellule in una sola volta da 10 a 6 cellule per millilitro di tampone substrato ALDH. Per generare una sospensione di una singola cellula da un campione di tessuto, utilizzare lame chirurgiche con tecnica incrociata per tritare il tessuto tumorale in pezzi di circa un millimetro. Mettere i pezzi in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di tampone di dissociazione.Sigillare la provetta con parafilm per un'incubazione di 40 minuti a 37 gradi Celsius in un agitatore e sedimentare i pezzi di tessuto digerito mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di tripsina utilizzando una pipetta da cinque millilitri e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, pipettare energicamente il tessuto più volte per rilasciare singole cellule e aggiungere una quantità sufficiente di terreno DMEM/F-12 per portare il volume totale nella provetta a 25 millilitri.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere il pellet in un millilitro di Displace DNAse e incubare per cinque minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, portare il volume totale a 10 millilitri con PBS. Mescolare le cellule mediante pipettaggio e farle passare attraverso un colino da 40 micron in una provetta da 50 millilitri.Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in cinque millilitri di PBS fresco per il conteggio. Per eseguire un saggio di formazione di colonie, dopo lo smistamento, risospendere le cellule in terreno completo e aggiungere il numero appropriato di cellule staminali del cancro al seno a ciascuna delle tre provette contenenti due millilitri di terreno per provetta, etichettate una volta 10 al secondo, due volte 10 al secondo o cinque volte 10 al secondo cellulare. Pipettare su e giù cinque volte per miscelare accuratamente la sospensione cellulare e piastrarle in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti.Agitare delicatamente la piastra per ottenere distribuzioni cellulari uniformi e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari fino alla comparsa delle colonie. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzetto e colorare le cellule con 500 microlitri di soluzione di cristallovioletto allo 0,05% per pozzetto per 30 secondi. Al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti due volte con due millilitri di acqua per pozzetto per rimuovere il colorante in eccesso, e contare e registrare il numero totale di colonie per pozzetto mediante microscopia ottica con un ingrandimento di quattro o 10 volte.Per eseguire un saggio della mammosfera, dopo lo smistamento, risospendere le cellule in un mezzo di mammosfera completo e piastrelle a una densità di seduta di cinque volte 10 delle seconde cellule per centimetro quadrato di area per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti a bassissimo attacco. Prima di contare il numero di mammosfere per pozzetto mediante microscopia ottica, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per cinque-10 giorni. Per impostare un modello di coltura 3D, aggiungere con cura 50 microlitri di estratto di membrana basale a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti senza bolle e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire alla soluzione di polimerizzare.Aggiungere 100 microlitri di PBS dopo 10 minuti per evitare che lo strato di gel si secchi. Al termine dell'incubazione, sospendere le cellule selezionate da cinque a 50 volte da 10 a terze cellule per 200 microlitri di concentrazione di terreno di coltura 3D e sostituire il PBS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 200 microlitri di terreno contenente cellule. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 10-14 giorni prima di valutare le colture per la formazione di organoidi.Le cellule di carcinoma mammario umano che mostrano una maggiore attività enzimatica di ALDH esprimono alti livelli di CD44 e livelli bassi o negativi di espressione di CD24 e possono essere classificate come cellule staminali di cancro al seno. La percentuale di cellule staminali del cancro al seno all'interno della popolazione di massa può variare tra le linee cellulari o i pazienti e spesso dipende dallo stadio della malattia, con il cancro al seno più aggressivo che mostra in genere una percentuale più elevata di cellule staminali del cancro al seno. La capacità di una singola cellula di cancro al seno di autorinnovarsi e generare colonie di 50 cellule può essere valutata mediante saggi di formazione di colonie.La capacità delle cellule staminali del cancro al seno di autorinnovarsi in condizioni sperimentali indipendenti dall'ancoraggio può essere valutata mediante saggi della mammosfera. La coltura delle cellule del cancro al seno e dell'estratto della membrana basale consente alle cellule staminali del cancro al seno di formare strutture 3D che ricapitolano le condizioni in vivo. Inoltre, i modelli di xenotrapianto murino in vivo possono essere utilizzati per comprendere le differenze nella crescita, nell'auto-rinnovo, nella differenziazione e/o nella capacità di iniziare il tumore delle cellule staminali del cancro al seno rispetto alle cellule staminali non del cancro al seno o alle popolazioni di cellule di massa.Seguendo questa procedura, le cellule staminali isolate del cancro al seno possono essere utilizzate in studi trascrittomici, cinematici e metabolomici. Questo metodo offre ai ricercatori l'opportunità di esplorare il ruolo delle cellule staminali del cancro al seno nell'inizio del tumore, nelle metastasi, nella recidiva e nella resistenza alla terapia.

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