Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon
22 gennaio 2021
Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.
Questo nuovo metodo di colture sferoidi può essere utilizzato per studiare la tumorigenicità per analizzare la presenza di diverse popolazioni di cellule staminali tumorali e può anche essere ben applicato attraverso lo schermo ad alto put per nuovi farmaci. Questo è un sistema colto robusto e ripetitivo per generare un gran numero di sferoidi di dimensioni omogenee. Inoltre, questi sferoidi possono essere utilizzati per studiare le cellule staminali cancerose.
Questo metodo è impostato per studiare la biologia del cancro cronico, ma può essere facilmente impostato per studiare altri tumori cambiando le condizioni della cultura 3D. Assicurati di guardare le bolle nel mezzo, di non spostare troppo il piatto durante la formazione degli sferoidi e di fare attenzione quando raccogli gli sferoidi nel colino. Inizia pretrattando i pozzi di una piastra di 24 poggia pozzo con 500 micro litri di soluzione di risciacquo anti-aderenza per pozzo.
Dopo pochi secondi centrifuga la piastra in rotore a benna oscillante e risciacqua ogni bene con 2 millilitri di mezzo basale caldo. Osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che le bolle siano state completamente rimosse dai micro pozzi. Se non si osservano bolle, sciacquare nuovamente i pozzetti prima di aggiungere un millilitro di mezzo a matrice di membrana basale DMEM caldo a ciascun pozzo.
Per indurre la formazione di sferoidi, vedere la concentrazione desiderata di cellule Caco-2 in uno strato mono 2D in un piatto di 10 centimetri in DMEM integrato con 10%FBS e 1%antibiotici. Per la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un'atmosfera umidificata. Quando si raggiunge una confluenza dell'80%, lavare le cellule con cinque millilitri di PBS prima di trattare la coltura con due millilitri di Tripside-EDTA per due o cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quando le celle si sono staccate neutralizzare la tripina con quattro millilitri di DMEM completo. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimorsi la tavolozza nel volume appropriato del mezzo matrice di membrana basale DMEM per ottenere la concentrazione desiderata di cellule in un millilitro di mezzo per pozzo. Aggiungere un millilitro di cellule ad ogni pozzo della piastra prepagata di 24 pozzetti, seguita dall'aggiunta di un millilitro di media matrice di membrana basale DMEM ad ogni pozzo.
Dopo la semina, centrifugare immediatamente la piastra e utilizzare un microscopio luminoso per verificare che le cellule siano state distribuite uniformemente attraverso i micro pozzi. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore senza disturbare le cellule. Per raccogliere gli sferoidi, alla fine dell'incubazione, utilizzare una pipetta sierologica e metà del supernatante in ogni pozzo per rimuovere delicatamente gli sferoidi dai loro micro pozzi.
Quando tutti gli sferoidi sono stati staccati, utilizzare la pipetta per trasferire accuratamente le colture 3D da ogni pozzo a un colino reversibile da 37 micron sopra un tubo conico da 15 millilitri. Lavare ogni pozzo tre volte con un millilitro di mezzo basale prebellico per lavaggio per raccogliere eventuali sferoidi rimanenti e aggiungere questi sferoidi aggiuntivi al colino. Dopo l'ultimo lavaggio controllare la piastra al microscopio per confermare che tutti gli sferoidi sono stati rimossi dai micro pozzi.
Quindi invertire il filtro su un nuovo tubo da 15 millilitri e lavare il fondo del filtro con un mezzo a matrice di membrana seminterrato DMEM fresco per raccogliere gli sferoidi nel tubo. Gli sferoidi stanno salendo da 500 cellule a dimostrazione dell'aumento più omogeneo delle dimensioni nel tempo. Con 500 e 600 cellule per sferoide determinare come il numero ottimale di cellule in cui è possibile ottenere una buona crescita e una bassa variabilità.
L'aggiunta della matrice a membrana basale migliora la crescita e l'omogeneità degli sferoidi. Nella coltura a lungo termine, le cellule appaiono come strati multipli densi al terzo giorno. Mentre le celle appiattite disposte in strati mono sono chiaramente visibili al giorno 10.
È interessante notare che un lume appare all'interno degli sferoidi dal quinto giorno in poi. Inoltre, un chiaro aumento delle cellule positive dell'antigene nucleare a cellule proliferati si osserva ai giorni cinque e sette che diminuiscono del giorno 10. Sorprendentemente, il Caspace 3 attivato si osserva in pochissime cellule solo al terzo e al quinto giorno.
Mentre alti livelli di espressione beta-catenina si osservano in ogni momento. Il potenziale degli sferoidi di differenziarsi in Anterosite è evidenziato dalla loro espressione di Phosphatase alcalina e portasoluto 2A5 mRNA. Inoltre, questi sferoidi esprimono i tipici marcatori di cellule staminali tumorali e rispondono a trattamenti chemioterapici combinati somministrati regolarmente ai pazienti oncologici colorettali.
Quindi gli sferoidi sono composti da diverse popolazioni cellulari. Possono quindi essere ben utilizzati per analizzare le risposte specifiche delle cellule a stimoli come i refrattari e, infine, per le risposte ai farmaci.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un sistema di coltura affidabile per la generazione di sferoidi tridimensionali a partire da cellule di adenocarcinoma del colon Caco2. Questo metodo consente lo studio della biologia delle cellule staminali tumorali e della loro risposta alla chemioterapia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoematologia
- Biologia Cellulare
Sfondo
- Comprendere le cellule staminali tumorali è fondamentale per sviluppare terapie efficaci.
- Le colture in sferoidi 3D imitano gli ambienti tumorali in vivo.
- Questo metodo può essere adattato per vari tipi di cancro.
- Robustezza e riproducibilità sono essenziali per la validità sperimentale.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per la coltura di sferoidi a partire da cellule Caco2.
- Indagare sulla tumorigenicità e sulle popolazioni di cellule staminali tumorali.
- Facilitare lo screening ad alto rendimento di nuovi farmaci.
Metodi Utilizzati
- Pretattamento delle pozzette con soluzione risciacquante antiadesione.
- Manipolazione accurata per evitare bolle durante la formazione degli sferoidi.
- Recupero degli sferoidi mediante l'uso di un setaccio.
- Monitoraggio delle condizioni di coltura per una crescita ottimale.
Risultati principali
- Generazione con successo di sferoidi di dimensioni omogenee.
- Applicabilità dimostrata per lo studio delle cellule staminali tumorali.
- Potenziale per applicazioni di screening farmacologico.
- Adattabilità ad altri tipi di cancro modificando le condizioni di coltura.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un nuovo strumento per la ricerca sul cancro.
- Migliora la comprensione della dinamica delle cellule staminali tumorali.
- Studi futuri potranno sfruttare questo sistema per lo sviluppo di terapie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo modello di sferoide 3D risponde all'esigenza fondamentale di sistemi preclinici in grado di riprodurre l'eterogeneità tumorale e i fenotipi delle cellule staminali tumorali (CSC), consentendo una valutazione più predittiva di bersagli terapeutici e risposte farmacologiche nella ricerca sul cancro del colon-retto. Fornendo una piattaforma riproducibile per l'arricchimento a lungo termine delle CSC e la valutazione della risposta alla chemioterapia, il metodo supporta le attività di validazione precoce dei bersagli e di identificazione di composti promettenti con una maggiore affidabilità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'eterogeneità delle CSC e del loro potenziale tumorigenico attraverso modelli differenziali di proliferazione e strutture simili a lumen all'interno degli sferoidi.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli arricchendo le CSC che esprimono marcatori consolidati, facilitando la riduzione del rischio meccanicistica delle ipotesi terapeutiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sferoidi di dimensioni omogenee a partire da un numero definito di cellule, creando un sistema standardizzato per l'analisi quantitativa della risposta ai farmaci.
- Valore operativo: Compatibile con flussi di lavoro di screening ad alto rendimento grazie alla robustezza, riproducibilità e facilità di raccolta dei sferoidi mediante metodi basati su filtri.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'espressione dei marcatori delle CSC e la risposta a chemioterapia combinata clinicamente rilevante, consentendo la modellizzazione preclinica della resistenza e sensibilità al trattamento.
- Valore operativo: Mantiene i fenotipi delle CSC durante colture a lungo termine, favorendo studi longitudinali sull'efficacia dei farmaci e sui meccanismi di recidiva tumorale.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla validazione preclinica, in particolare per programmi di oncologia incentrati su terapie dirette contro le cellule staminali tumorali e sui meccanismi di resistenza.
- Biologia della Scoperta: Favorisce la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico modellando nicchie di CSC e risposte differenziali ai farmaci in un contesto 3D.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso la formazione di sferoidi omogenei per dimensione, supportando screening affidabili di composti su popolazioni arricchite in CSC.
- Analisi: Fornisce letture quantitative mediante l'espressione di marcatori di CSC, marcatori di proliferazione (PCNA) e marcatori di apoptosi (Caspasi-3 attivata) per confrontare diverse condizioni di trattamento.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la risposta alla chemioterapia in un sistema rilevante per la malattia, che rispecchia l'eterogeneità dell'adenocarcinoma colorettale.
- Riutilizzo Aziendale: Adattabile ad altri tipi di cancro modificando le condizioni di coltura 3D, posizionandosi come una piattaforma riutilizzabile in diversi programmi di scoperta oncologica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore Scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella validazione degli bersagli catturando l'eterogeneità tumorale guidata dalle CSC e le proprietà funzionali di staminalità assenti nei modelli 2D.
- Valore Operativo: Garantisce riproducibilità e scalabilità attraverso un'ottimizzazione standardizzata del seeding, un pretrattamento anti-adesivo e un recupero basato su setacci, riducendo la variabilità nella generazione di sferoidi.
- Valore Strategico: Migliora i processi decisionali di tipo go/no-go consentendo una valutazione precoce di composti mirati alle CSC e ai meccanismi di resistenza, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul Portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati in base alla modulazione delle CSC e ai dati di risposta alla chemioterapia ottenuti da un modello fisiologicamente rilevante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di coltura cellulare 3D, inclusi il trattamento di superfici anti-adesive e una manipolazione accurata per prevenire la formazione di bolle durante l'avvio della formazione degli sferoidi.
- Dipende dall'accesso a matrice della membrana basale (ad esempio, Matrigel) e a strumentazione standard per colture cellulari, inclusi centrifughi, filtri (37 micron) e microscopi invertiti per il monitoraggio.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla densità di semina (500–600 cellule/sferoide) e ai tempi di incubazione, al fine di garantire omogeneità e riproducibilità tra esperimenti.
- L'adattamento ad altri tipi di cancro richiede un'ottimizzazione della concentrazione della matrice della membrana basale e della durata della coltura, in base alla cinetica di adesione e formazione degli sferoidi specifica per ciascuna linea cellulare.
- I limiti pratici includono la necessità di una manipolazione delicata durante il raccolto per evitare il danneggiamento degli sferoidi e la potenziale variabilità nei tempi di formazione della lume tra diversi lotti.
