Name: Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: Scopri un flusso di lavoro di proteomica quantitativa integrata per campioni di tessuto che combina approcci con e senza etichetta usando Orbitrap Fusion. Questo metodo supporta la scoperta di biomarcatori con elevata riproducibilità.

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Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.

Questo studio è stato esaminato e approvato dai comitati di revisione istituzionali e dal comitato etico dell'Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso scritto a partecipare a questo studio.
1. Preparazione del lisito tissutale
NOTA: eseguire tutti i seguenti passaggi sul ghiaccio per mantenere inattive le proteasi. Assicurarsi che i bisturi e gli eventuali tubi utilizzati siano sterili per evitare qualsiasi contaminazione incrociata.
<ol><li>Prendi ~ 30 mg di tessuto in un tubo che batte le perline, aggiungi 200 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) e vorticizzala. NOTA: In questo studio, sono stati prelevati tessuti tumorali cerebrali umani congelati freschi per la preparazione del lisi. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi tessuto fresco congelato con alcune modifiche a seconda del tipo di tessuti (tessuti molli o duri) e della complessità cellulare dei tessuti.</li>
	<li>Successivamente, ruotare il tubo per sistemare il tessuto e rimuovere con cura il PBS usando una pipetta. Eseguire un altro lavaggio PBS se ci sono ancora tracce di sangue lasciate nel tessuto.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di tampone di lisi dell'urea (8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) e cocktail inibitore della proteasi (PIC) secondo il protocollo del produttore. NOTA: Il volume del tampone di lisi dovrebbe essere sufficiente per macinare il tessuto durante il processo di sonicazione e per sospendere ciò che viene estratto. Troppo poco tampone di lisi può causare una lisi tissutale inefficiente, mentre troppo tampone di lisi diluirà il lisi proteico.</li>
	<li>Posizionare il tubo sul ghiaccio e sonicare il tessuto ad un'ampiezza del 40% per 2,5 minuti con cicli di impulsi di 5 s (ON / OFF, rispettivamente).</li>
	<li>Aggiungere perle di zirconio ai tubi e omogeneizzare il tessuto utilizzando un battitore di perle per 90 s con 5 minuti di incubazione su ghiaccio. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
	<li>Una volta che il tessuto è adeguatamente omogeneizzato, incubare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 6.018 x g per 15 minuti a 4 °C per separare i detriti cellulari dal surnatante.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante nel tubo fresco etichettato e conservare a -80 °C come aliquote fino a nuovo utilizzo.</li>
</ol>2. Quantificazione delle proteine e controllo di qualità dei llisi tissutali
<ol><li>Quantificare la concentrazione proteica nel llisito tissutale utilizzando il reagente di Bradford come descritto nel file supplementare 1.</li>
	<li>Dopo la quantificazione delle proteine, eseguire 10 μg di llisi tissutale su un gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità del lisiato. NOTA: L'ulteriore trasformazione a valle deve essere effettuata solo per i lasaggiù dei controlli di qualità.</li>
</ol>3. Digestione enzimatica delle proteine
NOTA: i passaggi per la digestione enzimatica sono mostrati nella Figura 1a.
<ol><li>Per la digestione, prendere 50 μg di proteine e aggiungere ddH2O per aumentare il volume a 20 μL.</li>
	<li>Ora, preparare 20 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) dal magazzino (0,5 M TCEP) aggiungendo 0,8 μL da stock al lasato proteico per ridurre i legami disolfuro nelle proteine e incubare il campione a 37 ° C per 60 minuti.</li>
	<li>Preparare 40 mM di iodoacetammide (IAA) in ddH2O e aggiungere 1,6 μL per alchilare i residui ridotti di cisteina. Incubare al buio per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere tampone di diluizione contenente 25 mM Tris pH 8,0 e 1 mM CaCl2 in un rapporto 1:8 per diluire la concentrazione di urea a meno di 1 M nel campione. A questo punto, controllare il pH. NOTA: Se si utilizza la tripsina come enzima digestivo, assicurarsi che la concentrazione di urea sia inferiore a 1 M.</li>
	<li>Per eseguire la digestione, aggiungere tripsina ad un rapporto enzima/substrato di 1:50. Incubare i tubi a 37 °C in un bagno secco tremante per 16 ore per la digestione notturna. NOTA: L'enzima tripsina è una proteasi altamente reattiva che è incline all'autodigestione. Prestare particolare attenzione ed eseguire rapidamente l'aggiunta di tripsina sul ghiaccio.</li>
	<li>Dopo 16 ore di incubazione, asciugare i peptidi digeriti in un concentratore sottovuoto.</li>
</ol>4. Dissaliazione dei peptidi digeriti
NOTA: Per eseguire la dissalo dei peptidi, utilizzare le punte dello stadio C18.
<ol><li>Attivare la punta dello stadio C18 aggiungendo 50 μL di metanolo. Centrifugare la punta a 1.000 x g per 2 minuti a RT. Scartare il filtrato raccolto sul fondo del tubo. Ripeti due volte.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di acetonitrile in acido formico allo 0,1% per lavare la punta del palco. Centrifugare il tubo a 1.000 x g per 2 minuti a RT. Scartare il filtrato raccolto sul fondo del tubo. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL dello 0,1% (v/v) FA per equilibrare la colonna. Ancora una volta, eseguire la centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti a RT e scartare il filtrato.</li>
	<li>Ricostituire i peptidi essiccati digeriti in 50 μL di acido formico allo 0,1%. NOTA: evitare la formazione di bolle d'aria all'interno delle punte dello stadio durante il passaggio del campione. Le punte dello stadio non devono essere completamente asciugate durante la fase di centrifugazione, poiché l'essiccazione può portare alla perdita di peptidi.</li>
	<li>Aggiungere i peptidi ricostituiti nella punta dello stadio attivato e far passare il campione attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti. Ripetere questo passaggio almeno quattro volte. Conservare il flusso a 4 °C.</li>
	<li>Per lavare il campione, aggiungere 50 μL di acido formico allo 0,1% (v/v). Ripetere la fase di centrifugazione ed eliminare il filtrato.</li>
	<li>Per l'eluizione dei peptidi, aggiungere 50 μL di 40% (v/v) ACN in acido formico allo 0,1% (v/v) e passarlo attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione. Raccogliere il filtrato in un tubo fresco. Ripetere il passaggio con il 50% e il 60% di ACN in acido formico allo 0,1% e raccogliere il filtrato nello stesso tubo fresco.</li>
	<li>Asciugare i peptidi dissalettati raccolti nel tubo fresco utilizzando un concentratore sottovuoto. NOTA: I peptidi essiccati dissalato sono pronti per essere iniettati, oppure possono essere conservati a -20 °C per 6 mesi. Per la conservazione a lungo termine (>6 mesi), conservare i peptidi a -80 °C.</li>
</ol>5. Quantificazione dei peptidi dissali
<ol><li>Ricostituire i peptidi essiccati dissalato in 0,1% FA.</li>
	<li>Pulire la piastra di misurazione fotometrica con tessuto privo di lanugine utilizzando il 70% di etanolo.</li>
	<li>Utilizzare 2 μL dello 0,1% FA per impostare lo spazio vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di campioni ricostituiti sulla piastra in replica.</li>
	<li>Posizionare la piastra nello spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 205 nm e 280 nm.</li>
	<li>Calcolare l'assorbibilità molare (ε) utilizzando la seguente formula: ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205] NOTA: L'assorbimento molare (ε) è una misura della probabilità della transizione elettronica o di quanto bene una specie assorbe la particolare lunghezza d'onda della radiazione che viene incidente su di essa. Il valore di ε dovrebbe essere compreso tra 31 mL mg-1cm-1 a 33 mL mg-1cm-1. Se il valore non rientra nell'intervallo, significa che i campioni non vengono digeriti correttamente.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione peptidica in μg/μL utilizzando la seguente formula: Concentrazione di peptide = Net OD (205) / 0.051 * ε</li>
</ol>6. Quantificazione senza etichetta (LFQ) dei peptidi digeriti
NOTA: per una quantificazione senza etichetta, utilizzare i parametri LC e MS menzionati nel file supplementare 2. Un dato ad alta copertura è stato ottenuto quando tre repliche biologiche dello stesso tipo di campione sono state eseguite nello spettrometro di massa.
<ol><li>Configurazione della cromatografia liquida<ol>
<li>Dopo la quantificazione dei peptidi desaltati, prendere 2 μg di peptidi in una fiala e portare il volume a 10 μL usando lo 0,1% di FA. La concentrazione di peptidi desaltati sarà di 200 ng/μL.</li>
		<li>Aprire l'autocampionatore del sistema di cromatografia liquida (vedere Tabella dei materiali)e posizionare il flaconcino all'interno dell'autocampionatore.</li>
		<li>Utilizzare 0,1% (v/v) FA per equilibrare la colonna preliminare e la colonna analitica.</li>
		<li>Prendere 1 μg di peptide digerito dissalato dal flaconcino e caricarlo sulla colonna.</li>
		<li>Impostate il gradiente LC in base alla complessità del campione. In questo esperimento, il gradiente LC è stato utilizzato per 120 minuti per la quantificazione senza etichetta dei campioni di tessuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ms setup: Prima di ottimizzare qualsiasi test proteomico, eseguire un controllo di qualità dello strumento monitorando alcuni peptidi di albumina sierica bovina (BSA) utilizzando qualsiasi software per l'idoneità del sistema e analizzando la copertura di BSA(Figura 2A,B). I parametri di acquisizione sono stati impostati nello strumento utilizzando il software di acquisizione dati MS (vedi Tabella dei materiali).<ol>
<li>Aprire il software, fare doppio clic su Instrument Set Up e selezionare il modello da peptides-ID con i parametri predefiniti.</li>
		<li>Impostare i parametri MS utilizzando il file supplementare 2 e salvarlo come nuovo metodo.</li>
		<li>Ora, apri il software per riempire i dettagli di esempio; Fare doppio clic su Impostazione sequenzae inserire i dettagli quali il tipo di campione, il nome del campione, la posizione di salvataggio del file, il file del metodo dello strumento, il volume di iniezione e la posizione del campione.</li>
		<li>Una volta compilate tutte le informazioni, selezionare la riga e avviare Esegui.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Quantificazione basata sull'etichetta (iTRAQ) dei peptidi digeriti
NOTA: la quantificazione basata su etichette può essere eseguita utilizzando diverse etichette isobariche come reagenti iTRAQ o TMT, ecc. Qui, iTRAQ 4-plex è stato utilizzato per l'etichettatura di peptidi digeriti da tre campioni di tessuto. La procedura di etichettatura iTRAQ 4-plex è menzionata di seguito.
<ol><li>Etichettatura di peptidi digeriti utilizzando reagenti iTRAQ. NOTA: In questo esperimento vengono utilizzati peptidi da tre campioni di tessuto. Da ciascun campione di tessuto, 80 μg di peptidi digeriti vengono prelevati in quattro provette per l'etichettatura con reagenti iTRAQ (114, 115, 116 e 117) (vedere il file supplementare 3 per i parametri sperimentali dettagliati).<ol>
<li>Prima di utilizzare il reagente iTRAQ, portare ogni flaconcino del reagente a temperatura ambiente (circa 5 minuti). Dare un breve giro di circa 30 s per portare la soluzione sul fondo di ogni flaconcino. NOTA: Assicurarsi che in ogni flaconcino siano presenti 10-15 μL di soluzione.</li>
		<li>Per l'etichettatura iTRAQ, ricostituire i peptidi essiccati in 20 μL di tampone di dissoluzione fornito nel kit di etichettatura iTRAQ.</li>
		<li>Ricostituire le etichette aggiungendo 70 μL di etanolo dal flaconcino fornito nel kit e mescolare la soluzione per 30 s e ruotarla per 10 s. NOTA: Si consiglia di eseguire tutti i passaggi secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Aggiungere le etichette iTRAQ omogeneamente miscelate (114, 115, 116 e 117) alle rispettive provette contenenti campioni di peptidi e consentire la reazione di etichettatura.</li>
		<li>Mescolare i componenti di ciascun tubo ruotando il tubo per 30 s, quindi ruotare il tubo per 10 s per riportare la miscela sul fondo del tubo. NOTA: Controllare il pH della soluzione utilizzando carta pH. Il pH dovrebbe essere superiore a 8; in caso contrario, aggiungere fino a 10 μL del tampone di dissoluzione per regolare il pH.</li>
		<li>Incubare ogni tubo a temperatura ambiente per 90 min. Alla fine della reazione, spegnere qualsiasi etichetta non legata in eccesso nel tubo aggiungendo acqua di grado MS.</li>
		<li>Incubare i tubi a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora.</li>
		<li>Una volta terminata l'incubazione, trasferire tutto il contenuto etichettato in un singolo tubo e asciugare i peptidi etichettati in un concentratore sottovuoto. NOTA: per l'etichettatura TMT è possibile seguire una procedura di etichettatura simile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurazione della cromatografia liquida<ol>
<li>Ricostituire i campioni in acido formico allo 0,1%, aprire l'autocampionatore di nano LC e posizionare i campioni all'interno dell'autocampionatore. Utilizzare i parametri menzionati nel file supplementare 2 per l'installazione di LC.</li>
		<li>Impostare il gradiente LC in base alla complessità del campione. Il gradiente LC di 180 minuti è stato utilizzato in questo esperimento per la quantificazione basata su etichette (iTRAQ) dei campioni di tessuto. NOTA: per campioni meno complessi, il gradiente corto può separare in modo efficiente la maggior parte dei peptidi. Tuttavia, se il campione è molto complesso, utilizzare un gradiente più lungo per una migliore separazione dei peptidi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurazione MS per la tecnica iTRAQ<ol>
<li>Impostare tutti i parametri MS per la quantificazione basata su etichette nello stesso modo utilizzato per la quantificazione senza etichetta, ad eccezione dell'energia di collisione, che è stata impostata al 35% per la frammentazione MS/MS nella quantificazione basata su etichette.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Analisi dei dati
<ol><li>Analizzare i file grezzi (spettro MS/MS) ottenuti dallo spettrometro di massa LC utilizzando un software di analisi disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Il database Human Reference Proteome di Uniprot (UP000005640) comprendente 71.785 sequenze proteiche è stato utilizzato per ottenere identità proteiche utilizzando i motori di ricerca Sequest HT e Mascot (v2.6.0). I parametri per la quantificazione senza etichetta e la quantificazione basata su etichette sono descritti nel file supplementare 4.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Spiega anche il meccanismo di segnalazione e le vie associate alla progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati riproducibili di buona copertura. La maggior parte dei passaggi sono stati adattati dalle istruzioni del produttore. Per ottenere dati di alta qualità, i seguenti passaggi sono fondam...

Le tecnologie di proteomica hanno il potenziale per consentire l'identificazione e la quantificazione di potenziali marcatori candidati che possono aiutare nella rilevazione e nella prognosi della malattia1. I recenti progressi nel campo della spettrometria di massa hanno accelerato la ricerca clinica a livello proteico. I ricercatori stanno cercando di affrontare la sfida della patobiologia complicata di diverse malattie utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, che ora offre una maggiore sensibilità per l'identificazione e la quantificazione delle proteine2. Una misurazione quantitativa accurata delle proteine è fondamentale per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine in individui sani e malati3; tuttavia, tale analisi su scala proteoma non è facile.
Uno dei principali limiti della profilazione proteomica dei campioni clinici è la complessità dei campioni biologici. Molti diversi tipi di campioni sono stati studiati per studiare il proteoma della malattia, come linee cellulari, plasma e tessuti4,5. Le linee cellulari sono ampiamente utilizzate come modelli in esperimenti in vitro per imitare diversi stadi di progressione della malattia. Tuttavia, una delle principali limitazioni con le linee cellulari è che acquisiscono facilmente cambiamenti genotipici e fenotipici durante il processo di coltura cellulare6. I fluidi corporei come il plasma potrebbero essere una fonte interessante per la scoperta di biomarcatori; tuttavia, a causa delle proteine molto abbondanti e della gamma dinamica di concentrazione proteica, la proteomica plasmatica è un po 'più impegnativa7. Qui, i peptidi originati dalle proteine più abbondanti possono sopprimere quelli derivati dalle proteine a bassa abbondanza anche se il rapporto massa/carica è lo stesso6. Sebbene ci siano stati progressi nelle tecnologie di esaurimento e frazionamento negli ultimi anni, ottenere una buona copertura rimane ancora una delle principali limitazioni della proteomicaplasmatica 8,9. L'uso di tessuti per l'indagine proteomica della biologia della malattia è preferito in quanto i campioni di tessuto sono più prossimali ai siti di malattia e offrono elevate informazioni fisiologiche e patologiche per fornire migliori informazioni sulla biologia della malattia10,11.
In questo manoscritto, abbiamo fornito un protocollo semplificato per la proteomica quantitativa di campioni di tessuto. Abbiamo utilizzato un tampone contenente 8 M di urea per la preparazione del lisato tissutale in quanto questo tampone è compatibile con le indagini basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, è obbligatorio pulire i peptidi per rimuovere i sali prima di iniettarli nello spettrometro di massa. Un punto importante da ricordare è quello di ridurre la concentrazione di urea a meno di 1 M prima di aggiungere tripsina per la digestione delle proteine poiché la tripsina mostra una bassa attività a 8 M di concentrazione di urea. Abbiamo spiegato due approcci di proteomica globale quantitativa: la quantificazione basata su etichette utilizzando iTRAQ (tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta) e la quantificazione senza etichetta (LFQ). La proteomica quantitativa basata su iTRAQ viene utilizzata principalmente per confrontare più campioni che variano nelle loro condizioni biologiche (ad esempio, campioni normali rispetto a campioni di malattia o trattati). L'approccio utilizza reagenti isobarici per etichettare le ammine primarie N-terminali dei peptidi12. I reagenti iTRAQ contengono un gruppo reporter N-metil piperazina, un gruppo bilanciatore e un gruppo estere N-idrossi succinimide che reagisce con le ammine primarie N-terminali dei peptidi13. I peptidi digeriti da ciascuna condizione sono etichettati con un particolare reagente iTRAQ. Dopo l'etichettatura, la reazione viene interrotta e i peptidi etichettati da diverse condizioni vengono raggruppati in un singolo tubo. Questa miscela di campioni combinati viene analizzata dallo spettrometro di massa per l'identificazione e la quantificazione. Dopo l'analisi MS/MS, vengono generati frammenti ioniche reporter con basse masse molecolari e le intensità ioniche di questi ioni reporter vengono utilizzate per la quantificazione delle proteine.
Un altro approccio, la quantificazione senza etichetta, viene utilizzato per determinare il numero relativo di proteine in campioni complessi senza etichettare peptidi con isotopi stabili.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado MS</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato Soluzione salina</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Merck</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (grado MS)</td><td>Pierce</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagente</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000205</tr><tr><td>Urea</td><td>Merck</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 colonna</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Punte per tavolino</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>Perle di zirconia/silice</td><td>BioSpec prodotti</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Battitore di perline (Omogeneizzatore)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A Lettore</td><td></td></tr> di <tr><td>micropiastre (spettrofotometro)</td><td>Thermo</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Sonics</td><td>Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Bagno secco a scuotimento</td><td>Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Spettrometro di massa a fusione</td><td>Thermo</td><td>FSN 10452</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC</td><td>Thermo</td><td>EASY-nLC1200</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer</td><td>Thrermo</td><td>Proteome Discoverer 2.2.0.388</td><td></td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno portato a un'analisi proteomica profonda insieme alla generazione di set di dati robusti e riproducibili. Tuttavia, nonostante i notevoli progressi tecnici, la preparazione del campione da parte di biocampimenti come il sangue del paziente, il CSF e il tessuto pone ancora sfide considerevoli. Per identificare i biomarcatori, la proteomica tissutale spesso fornisce un'interessante fonte di campioni per tradurre i risultati della ricerca dal banco alla clinica. Può rivelare potenziali biomarcatori candidati per la diagnosi precoce del cancro e delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, ecc. La proteomica tissutale produce anche una ricchezza di informazioni sistemiche basate sull'abbondanza di proteine e aiuta ad affrontare interessanti questioni biologiche.
L'analisi proteomica quantitativa può essere raggruppata in due grandi categorie: un approccio basato su etichette e un approccio privo di etichette. Nell'approccio basato sull'etichetta, le proteine o i peptidi sono etichettati utilizzando isotopi stabili come SILAC (etichettatura isotopica stabile con amminoacidi in coltura cellulare) o da tag chimici come ICAT (tag di affinità codificati con isotopi), TMT (tag di massa tandem) o iTRAQ (tag isobarico per la quantificazione relativa e assoluta). Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine e utilizzando etichette isobariche, è possibile analizzare più campioni in un singolo esperimento. L'approccio senza etichette fornisce un'alternativa economica agli approcci basati sulle etichette. Centinaia di campioni di pazienti appartenenti a una particolare coorte possono essere analizzati e confrontati con altre coorti in base alle caratteristiche cliniche. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ottimizzato per campioni di tessuto utilizzando metodi di profilazione del proteoma privi di etichette e basati su etichette, che è fondamentale per le applicazioni nelle scienze della vita, in particolare i progetti basati sulla scoperta di biomarcatori.

Abbiamo utilizzato due diversi approcci per la proteomica di scoperta: approcci di proteomica senza etichetta e basati su etichette. Il profilo proteico dei campioni di tessuto su SDS-PAGE ha mostrato le proteine intatte e potrebbe essere considerato per l'analisi proteomica (Figura 2A). Il controllo di qualità dello strumento è stato monitorato tramite un software di idoneità del sistema e ha mostrato la variazione giornaliera delle prestazioni dello strumento (<strong class="xfig"...

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Misurazioni quantitative accurate delle proteine sono fondamentali per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine per comprendere la malattia fino alla biologia. L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di fornire un flusso di lavoro quantitativo integrato di proteomica per campioni di tessuto, combinando il profilo proteico senza etichetta e basato su etichette per la scoperta di biomarcatori. In questo studio, abbiamo utilizzato lo strumento Orbitrap Fusion per quantificare le proteine utilizzando approcci basati su etichette e senza etichette.La lisi tissutale è uno dei passaggi più cruciali per il successo di un esperimento LC-MS-MS. Prendi 30 mg di tessuto in un tubo che batte le perle. Dopo il lavaggio con il PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi dell'urea contenente otto urea molare, Tris, NaCl e MgCl2.Utilizzando un sonicatore a sonda, lisi il contenuto del tessuto. Ripeti questa operazione per un altro ciclo. Se si osserva un tessuto intatto sul fondo del tubo, aggiungere perle di zirconio al tubo e omogeneizzare il tessuto usando un battitore di perle per 90 secondi, con cinque minuti di incubazione sul ghiaccio.Centrifugare i campioni intorno a 6000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per separare i detriti cellulari dal surnatante. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e mescolare uniformemente la soluzione. Quantificare la concentrazione proteica nel llisito tissutale utilizzando il reagente di Bradford.Per questo, misurare l'OD del campione a 595 nanometri ed estrapolarlo utilizzando un grafico standard come mostrato in questa schermata. Dopo la quantificazione delle proteine, eseguire 10 microgrammi di llisi tissutale su gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità dei lasati. Il primo passo nella digestione in soluzione comporta la riduzione dei legami disolfuro, utilizzando TCEP.Dopo l'aggiunta di TCEP, incubare il contenuto del tubo per un'ora a 37 gradi Celsius. Il passo successivo prevede l'alchilazione per impedire la ricomatura dei legami disolfuro ridotti. Aggiungere un agente alchilante come la iodoacetammide e incubare il tubo al buio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, abbassare la concentrazione finale di urea a meno di un molare diluendo con quattro-otto volumi di tampone di diluizione. A questo punto, è consigliabile controllare il pH. Il passo successivo prevede l'aggiunta di tripsina al tubo e l'incubazione del tubo durante la notte per una digestione efficiente.Il giorno successivo, asciugare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto e procedere alla fase di dissamatrice. Per eseguire la dissalo dei peptidi, utilizzare le punte dello stadio C18. Attivare la punta dello stadio C18 aggiungendo 50 microlitro di metanolo, centrifugare la punta a 1000 G per due minuti.Ora, aggiungere 50 microlitro di acetonitrile in acido formico allo 0,1% per lavare la punta del palco e, di nuovo, centrifugare la punta. Ricostituire i peptidi digeriti essiccati in 50 microlitri di acido formico allo 0,1%. Aggiungere i peptidi ricostituiti nella punta dello stadio attivato.Ripetere questo passaggio almeno quattro volte. Per lavare il campione, aggiungere 50 microlitro di acido formico allo 0,1% e ripetere la fase di centrifugazione. Per l'eluizione dei peptidi, aggiungere 50 microlitri di 40% ACN in acido formico allo 0,1% e passarlo attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione.Ripetere questo passaggio con 50% e 60% ACN in acido formico 0,1% e raccogliere il filtrato in un tubo fresco. Asciugare i peptidi dissalettati usando un concentratore a vuoto. Prima dell'esecuzione di LC-MS-MS, quantificare i peptidi utilizzando il metodo Scopes.Per questo, caricare due microlitri di campione ricostituito nel pozzettilo di una piastra microgocce e misurare l'assorbanza a 205 nanometri e 280 nanometri. Calcola la concentrazione dalla formula descritta in questa diapositiva. Una volta che i peptidi dissali sono essiccati, sono pronti per la quantificazione basata sull'etichetta.Per l'etichettatura iTRAQ, i peptidi essiccati devono essere ricostituiti in 20 microlitri di tampone di dissoluzione, forniti nel kit di etichettatura iTRAQ. Ricostituire le etichette aggiungendo etanolo dal flaconcino fornito nel kit e mescolare accuratamente. Si consiglia di eseguire tutti i passaggi secondo le istruzioni del produttore.Aggiungere le etichette iTRAQ omogeneamente miscelate ai rispettivi tubi e consentire la reazione di etichettatura. Alla fine della reazione, spegnere qualsiasi etichetta non legata in eccesso nel tubo aggiungendo acqua di grado MS e incubare da mezz'ora a un'ora. Ora, trasferire tutto il contenuto etichettato in un singolo tubo e asciugare i peptidi etichettati.Dopo aver ricostituito i campioni in acido formico allo 0,1%, aprire l'autocampionatore di NanoLC e posizionare i campioni all'interno dell'autocampionatore. Una volta che i campioni sono stati inseriti nell'autocampionatore, è importante impostare i giusti parametri per la cromatografia liquida e la spettrometria di massa. Qui, descriviamo i parametri sia per la quantificazione senza etichetta che per la quantificazione basata su iTRAQ utilizzando LC-MS.In caso di quantificazione senza etichetta, è stato utilizzato un gradiente di 120 minuti come iniezione di un singolo campione non sezionato. Questa durata può essere aumentata o diminuita in base alla complessità del campione. In questo esperimento, è stato impostato un flusso di 300 nanolitri al minuto con il seguente gradiente per la soluzione B, che è l'80% di acetonitrile in acido formico all'1%, in questo caso.Allo stesso modo, possiamo impostare un gradiente per un esperimento iTRAQ. Poiché i campioni non sono sottoposti a frazionati, è stato utilizzato un gradiente di 90 minuti. I parametri MS sia per la quantificazione senza etichetta, sia per la quantificazione basata sull'etichetta iTRAQ, possono essere visti qui.Il primo passo prevede l'impostazione della modalità applicazione facendo clic sui parametri globali. Selezionare la modalità peptide e impostare la durata del metodo in base al gradiente LC utilizzato. Definire i parametri di scansione per l'esperimento.Facendo clic sull'opzione MS-OT, i parametri diventano visibili. Il tipo di rilevatore in uso è impostato su Orbitrap. L'altra opzione disponibile su questo strumento include una trappola ioio.La risoluzione è stata impostata su 60.000 e si può scegliere tra diverse opzioni disponibili, a seconda delle esigenze e del tipo di esperimento. L'intervallo di massa è normale e l'intervallo di scansione è impostato da 375 a 1700. Gli altri parametri sono predefiniti per MS Application.La soglia di intensità è stata impostata e lo stato di carica impostato nell'intervallo da due a sei. L'esclusione dinamica è stata impostata su 40 secondi e la tolleranza di massa è stata mantenuta a 10. Il set successivo di parametri include i parametri MS-MS.La modalità di isolamento è stata selezionata con quadrupolo, finestra di isolamento impostata a due, offset di isolamento è stato impostato su off e il tipo di attivazione è solitamente HCD per l'esperimento di proteomica. L'energia di collisione può essere riparata o può essere assistita. I campioni etichettati richiedono energie di collisione più elevate, quindi, per gli esperimenti iTRAQ, è consigliabile che l'energia di collisione sia impostata su 35, mentre per gli esperimenti LFQ può essere impostata su 30.Il tipo di rivelatore utilizzato qui è Orbitrap. La modalità intervallo di scansione sarà automatica. Gli altri parametri sono predefiniti per gli esperimenti iTRAQ e l'esperimento quantitativo senza etichetta.Cliccando sul riepilogo si otterrà una panoramica di tutti i parametri LC e MS utilizzati per l'esperimento. Puoi dare un'occhiata a ogni singolo parametro e fare la correzione di bozze. Una volta fatto, fai clic sul file e salvalo come file di metodo.Una volta salvato, puoi eseguire il metodo e otterrai i file raw. E poi quei file raw possono essere analizzati utilizzando il software Proteome Discoverer. Questa figura mostra la copertura della sequenza di BSA in tre repliche tecniche, che è il 91% nelle tre repliche.Questo indica la riproducibilità dello strumento. Ora, questa figura mostra l'uniformità nel numero di corrispondenze spettrali peptidiche, peptidi e proteine identificate in tre diversi campioni biologici, il che, ancora una volta, dà un'idea della riproducibilità dello strumento. Qui, il diagramma di Venn rappresenta le proteine comuni ed esclusive identificate in tre diversi campioni in esperimenti senza etichetta e esperimenti basati su etichette.Questi grafici a barre mostrano il numero di corrispondenze spettrali peptidiche, gruppi peptidici, proteine totali, gruppi proteici e numero di proteine dopo l'1% FDR, identificati nell'esperimento LFQ e iTRAQ. La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati di buona copertura riproducibili.L'uso di repliche tecniche garantisce una buona riproducibilità, anche se i campioni vengono eseguiti in momenti diversi. Qui, abbiamo mostrato l'analisi di campioni di tessuto utilizzando due metodi di quantificazione: proteomica senza etichetta e basata su etichette. La selezione delle tecniche proteomiche quantitative può dipendere dal numero di campioni, dalla disponibilità di piattaforme MS e dalla questione biologica da affrontare.

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Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Qui, presentiamo un metodo automatizzato di digestione delle proteine plasmatiche per l'analisi proteomica quantitativa basata sulla spettrometria di massa. In questo protocollo, le fasi di trasferimento e incubazione di liquidi per la denaturazione delle proteine, la riduzione, l'alchilazione e le reazioni di digestione della cipina sono semplificate e automatizzate. Ci vogliono circa cinque ore per preparare una piastra da 96 pozze con la precisione desiderata.

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Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

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Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.

Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

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Lipidomica shotgun di tessuti di roditori

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Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

I dati proteomici basati sulla spettrometria di massa sono disponibili in database aperti e accessibili utilizzando strumenti gratuiti. Data la complessità delle ricerche e delle descrizioni nei database, molti biologi non hanno le conoscenze per utilizzare questi set di dati. Qui, forniamo una guida sull'utilizzo di strumenti gratuiti per le ricerche di dati proteomici di base.

Navigazione dei dati proteomici basati sulla spettrometria di massa utilizzando strumenti computazionali gratuiti

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ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

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Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Scopri un flusso di lavoro di proteomica quantitativa integrata per campioni di tessuto che combina approcci con e senza etichetta usando Orbitrap Fusion. Questo metodo supporta la scoperta di biomarcatori con elevata riproducibilità.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

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