Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Il nostro protocollo facilita la stampa di strutture cellulari 3D preformate, come gli sferoidi epiteliali mammari, consentendo la rapida formazione di modelli biologicamente rilevanti e di una varietà di bio-inchiostri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la biostampa di sferoidi tumorali 3D su una rete vascolare che può essere utilizzata quasi immediatamente per qualsiasi studio sperimentale. Questi modelli di tessuto biostampati in 3D forniscono una rapida piattaforma in vitro che può essere espansa per la medicina di precisione personalizzata.

Questo metodo di bioprinting 3D altamente versatile può essere applicato ad altri sistemi fisiologici in cui le interazioni 3D con il sistema vascolare sono importanti. Per la formazione di sferoidi epiteliali mammari, congelare prima i puntali delle pipette da 200 microlitri per 30 minuti e posizionare la soluzione di matrice ridotta del fattore di crescita sul ghiaccio. Quando i puntali si sono congelati, utilizzando un nuovo puntale per pipetta ghiacciato per pozzetto, aggiungere 30 microlitri della soluzione di matrice ghiacciata sul lato e lungo gli angoli di ciascun pozzetto di un vetrino a camera a otto pozzetti, aggiungendo un'ultima goccia al centro per garantire un rivestimento uniforme.

Quando tutti i pozzetti sono stati rivestiti, incubare il vetrino a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 15-20 minuti. Mentre la matrice è in fase di polimerizzazione, risospendere le cellule MCF 10A nel terreno di saggio MCF 10A a una concentrazione di due volte 10 per cinque cellule per millilitro. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di cellule e 450 microlitri di terreno di crescita sferoidale MCF 10A a ciascun pozzetto e rimettere immediatamente il vetrino nell'incubatore.

Ogni quattro giorni, inclinare il vetrino della camera a un angolo di 45 gradi per consentire la sostituzione di 200 microlitri di surnatanti con un terreno di crescita sferoidale fresco per pozzetto. Per la formazione della rete HUVEC, preparare un vetrino da camera a otto pozzetti rivestito in soluzione di matrice come dimostrato e pre-colorare un piatto di 10 centimetri di HUVEC con 10 microlitri di die tracker di globuli rossi per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule endoteliali con 10 millilitri di PBS caldo prima di trattarle con due millilitri di tripsina EDTA allo 0,05%.

Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, neutralizzare la tripsina con cinque millilitri di terreno di crescita endoteliale due e trasferire le cellule in una provetta conica da 25 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno basale endoteliale privo di siero, due per il conteggio e diluire le cellule a una concentrazione di una volta 10 per sei cellule per millilitro. Quindi aggiungere una volta 10 ai cinque HUVEC in ciascun pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per sei ore.

Dopo cinque-otto giorni di coltura, contare il numero di sferoidi in ciascun pozzetto in immagini rappresentative al microscopio a contrasto di fase e utilizzare un puntale per pipetta da 1.000 microlitri con gli ultimi 0,5 centimetri del puntale rimossi per raccogliere con cura tutti gli sferoidi da ciascun pozzetto del vetrino della camera a otto pozzetti in una provetta da 50 microlitri. Risospendere gli sferoidi in un bio-inchiostro appropriato a una concentrazione di 100 sferoidi per 100 microlitri di inchiostro e caricare gli sferoidi raggruppati in una siringa sterile da 10 millilitri. Dotare la siringa di un ago sterile calibro 25 e collegare la siringa al sistema di biodeposizione.

Rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della rete HUVEC ed estrudere 100 microlitri di sferoidi epiteliali mammarie in ciascuno dei sei pozzetti del vetrino della camera della rete HUVEC ad una velocità di flusso di un millilitro di sferoidi al minuto. Quindi aggiungere 400 microlitri di terreno di coltura sferoidale MCF 10A a ciascun pozzetto e posizionare le co-colture nell'incubatore per colture cellulari per 24-96 ore. Dopo cinque-otto giorni di coltura, come dimostrato, gli sferoidi epiteliali mammari MCF 10A non tumorigenici dovrebbero apparire rotondi con un centro cavo con l'integrina alfa-6 polarizzata sul bordo esterno dello sferoide.

Le cellule epiteliali del carcinoma mammario MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari che possono mostrare la migrazione delle cellule fuori dagli sferoidi se mantenute nella coltura di Matrigel per troppo tempo. Dopo sei-otto ore di coltura sparsa senza siero, come dimostrato, le reti HUVEC possono essere visualizzate mediante contrasto di fase o microscopia confocale. Dopo la biostampa dello sferoide epiteliale mammario sulle reti HUVEC, sia gli sferoidi che le reti devono mantenere la loro morfologia originale per almeno 24 ore.

La cosa principale da ricordare quando si tenta questo protocollo è di maneggiare attentamente gli sferoidi prima di stampare per evitare il clustering. Dopo il bioprinting e la co-coltura, la vitalità delle cellule tumorali, la proliferazione, la migrazione e altre interazioni biochimiche con la rete endoteliale possono essere misurate con e senza un trattamento farmacologico. Abbiamo dimostrato che i test farmacologici possono essere avviati già due ore dopo la bio-coltura di co-coltura e abbiamo testato l'aggiunta di sferoidi alle reti endoteliali con il farmaco antitumorale paclitaxel.