Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo

Questo protocollo fornisce un metodo per effettuare confronti accurati fianco a fianco dell'efficacia relativa di composti antifungini volatili e non volatili in diverse fasi di crescita fungina. Questo metodo è adatto per valutare l'attività antifungina di prodotti di origine vegetale utilizzati in forme essiccate o liquide che contengono un'ampia diversità di molecole. Questo metodo può fornire informazioni preziose sulle modalità di applicazione dei prodotti di origine vegetale ed è particolarmente adatto nel campo del biocontrollo.

A dimostrare la procedura sarà Valentina Gligorijevic, assistente ingegnere del laboratorio Sup'Biotech. Per la raccolta dei conidi, sovrapporre tre millilitri di 0,05%Tween 20 su una coltura di micelio di trichoderma e utilizzare un rastrello per rilasciare i conidi dai conidiofori facendo attenzione a non premere sul micelio per evitare che le ife vengano strappate. Quando tutti i conidi sono stati rilasciati, utilizzare una micropipetta per recuperare rapidamente e aggiungere la soluzione di conidi in una provetta da 15 millilitri per il conteggio.

Per preparare le piastre fungine, depositare 100 microlitri di spore a una concentrazione di tre volte 10 a sei spore per millilitro su una piastra di Petri di nove centimetri contenente terreno PDA e utilizzare una spatola sterile per aggiungere 10 grammi di perle di vetro di due millimetri di diametro alla piastra. Quindi scuotere delicatamente la piastra in avanti e indietro e ruotare e ruotare la piastra in segmenti di 90 gradi fino a quando non è stata completamente ruotata per distribuire uniformemente le spore sulla superficie dell'agar. Quindi incubare la piastra a 30 gradi Celsius fino all'analisi dell'inibizione della crescita.

Per eseguire un saggio di inibizione per contatto con aglio in polvere, utilizzare una spatola sterile per pesare la quantità di aglio in polvere desiderata in singole provette da 50 millilitri, per ottenere concentrazioni generalmente comprese tra 0,25 e 16 milligrammi per millilitro. Aggiungere 10 millilitri di PDA a circa 45 gradi Celsius in ciascuna provetta e capovolgere accuratamente ciascuna provetta più volte per distribuire uniformemente la polvere in tutto l'agar.

Versare rapidamente le sospensioni omogeneizzate in piastre di Petri di cinque centimetri di diametro e lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente. Per eseguire un test di inibizione del contatto, utilizzare un tubo sterile in acciaio inossidabile di cinque millimetri di diametro per tracciare un cerchio al centro dell'agar nei piatti di controllo e trattati con composti antifungini e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per smaltire i cilindri di agar. Quindi, utilizzare un nuovo tubo di acciaio inossidabile di cinque millimetri di diametro per tracciare da 15 a 20 cerchi in modo casuale nelle placche fungine e utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire con cura le spore, le ife o i cilindri ricoperti di micelio nelle regioni vuote delle piastre PDA.

Quindi rimetti le piastre nell'incubatore a 30 gradi Celsius. Per preparare una piastra per un saggio di inibizione antifungina in fase vapore, versare 10 millilitri di terreno PDA nel coperchio di una piastra di Petri di cinque centimetri di diametro contenente 10 millilitri di terreno PDA contenente composti antifungini o terreno PDA da solo e lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente. Utilizzando una provetta centrifica da 50 millilitri come strumento di calibrazione, fare un cerchio di PDA al centro dell'agar e utilizzare una spatola sterile per rimuovere l'agar attorno al cerchio.

Utilizzare un tubo sterile in acciaio inossidabile di cinque millimetri di diametro per tracciare un cerchio al centro del mezzo nel coperchio e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per scartare il cilindro della coclea. Quindi utilizzare un tubo sterile in acciaio inossidabile di cinque millimetri di diametro per realizzare in modo casuale i tappi nelle piastre fungine preparate e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per trasferire con cura spore, ife o tappi rivestiti di micelio nei coperchi delle piastre di analisi. In questa analisi, l'inibizione della crescita delle specie di trichoderma SBT 10-2018 innescata da tre composti antifungini è stata valutata utilizzando saggi di inibizione della fase di contatto e vapore, come dimostrato per ogni stadio fungino.

È stata osservata una maggiore sensibilità delle spore al carbendazim rispetto alle prime reti di ife e micelio quando il trichoderma e i composti antifungini erano in contatto. Al contrario, il carbendozim non ha avuto alcun effetto antimicotico sul trichoderma quando il fungo è stato posto a una certa distanza dal fungicida in base alla bassa volatilità di questa sostanza. Quando l'olio essenziale di thymus vulgaris è stato utilizzato come composto antimicotico, è stata osservata una maggiore sensibilità per le spore e le ife precoci rispetto all'inibizione della crescita del micelio allo 0,025% di olio essenziale.

Come previsto, l'olio essenziale di thymus vulgaris ha presentato un'attività antifungina identica indipendentemente dalla distanza tra il fungo e l'olio. Quando è stato utilizzato l'aglio in polvere, è stata osservata una maggiore efficacia contro la germinazione delle spore e l'allungamento precoce delle ife rispetto alla crescita del micelio. Particolare attenzione deve essere prestata durante la preparazione della piastra fungina per assicurarsi che le spore siano distribuite uniformemente sulla superficie della piastra di agar per garantire risultati comparabili.