Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

La peptoglicomica utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano in dettaglio. L'utilizzo di algoritmi bioinformatici consente l'analisi, l'estrazione e il confronto dei dati di spettrometria di massa in una raccolta di file di dati contemporaneamente, riducendo il carico di lavoro e aumentando l'accuratezza. La comprensione delle diverse variazioni e modificazioni del peptidoglicano ha implicazioni nella comprensione dei processi cellulari, tra cui la crescita e la divisione, l'evasione immunitaria dell'ospite e la resistenza antimicrobica.

Si consiglia di preparare e analizzare prima un piccolo sottoinsieme di campioni per acquisire familiarità con il protocollo e fungere da progetto pilota per valutare i parametri sperimentali. Poiché il software di analisi dei dati per spettrometria di massa varia spesso nelle definizioni utilizzate per descrivere caratteristiche e funzioni, la dimostrazione visiva aiuterà gli utenti ad applicare questo protocollo su più piattaforme. Per l'estrazione del peptidoglicano sacculi, risospendere i pellet di cellule congelate a circa uno o 10 del volume di coltura originale in 20 millimolari di fosfato di sodio a quattro gradi Celsius prima di aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia per far bollire l'8% di SDS in 20 millimolari di fosfato di sodio fino a un volume finale di uno a uno.

Mantenere un'ebollizione delicata per 30 minuti o tre ore mescolando per garantire la completa dissociazione della membrana. La miscela risultante deve essere completamente limpida, senza grumi di cellule o viscosità residui. Quando la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, raccogliere il sacculo mediante ultracentrifugazione, seguita da cinque a sette lavaggi in circa 50 millilitri di fosfato di sodio a temperatura ambiente 20 millimolari per lavaggio fino a quando il tampone di lavaggio ha una concentrazione di SDS di circa lo 0,001% come determinato dal colorante colorimetrico.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il sacculo in 5-10 millilitri di fosfato di sodio a temperatura ambiente da 20 millimolari e integrare il campione con 50 microgrammi per millilitro di amilasi, DNasi e RNasi in solfato di magnesio da 10 millimolari per un'incubazione di un'ora con agitazione o nutazione a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, digerire la reazione durante la notte con 100 microgrammi per millilitro di pronasi a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, dopo l'ultra centrifugazione, far bollire il campione per un'ora in 25 millilitri di SDS al 2% e 20 millimolari di fosfato di sodio in una vaporiera.

Al termine dell'incubazione, lavare il campione da cinque a sette volte con 50 millilitri di acqua distillata a temperatura ambiente come dimostrato. Quando la concentrazione di SDS raggiunge circa lo 0,001%, risospendere il pellet in una quantità sufficiente di acqua bidistillata per ottenere una sospensione di sacculi e lavare il contenitore. Dopo la conservazione notturna a meno 80 gradi Celsius, liofilizzare il campione congelato prima di diluire il sacculi a 10 milligrammi di peptidoglicano per millilitro di doppia concentrazione di acqua distillata.

Per l'analisi LC-MS, avviare un nuovo progetto nel software dello strumento e assegnare i file di dati LC-MS QTOF appropriati alla condizione sperimentale di interesse. Eseguire la procedura guidata di elaborazione dati, l'estrazione ricorsiva in batch delle funzioni e impostare i filtri di elaborazione dei dati in modo che corrispondano ai parametri delle condizioni e della strumentazione LC-MS per identificare, raggruppare e verificare con precisione i picchi massa-carica che rappresentano i singoli muropeptidi. Esamina i risultati al termine dell'estrazione delle funzionalità.

Se un numero significativo di feature non è stato allineato in un gruppo, regolare i parametri di filtro ricorsivo per ampliare o limitare la finestra di rilevamento in base alle esigenze. Quindi esporta i dati come file di scambio composto. Per l'analisi delle caratteristiche spettrali differenziali, avviare un nuovo progetto nel software di sistema e seguire le istruzioni per l'importazione dei dati.

Durante l'analisi dei dati, selezionare la significatività e la variazione di piega per l'analisi differenziale e impostare i dati di base sull'intensità mediana in tutti i file di dati. Una volta completata l'analisi, esaminare le analisi grafiche e statistiche risultanti per identificare i muropeptidi che dimostrano un cambiamento significativo dell'abbondanza tra le condizioni sperimentali testate. Nel navigatore del progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse sulle varie analisi e selezionare un'opzione di esportazione per salvare i dettagli della funzione come file tsv.

Assicurati di salvare più analisi per ottenere tutti i dati rilevanti. All'interno del software di analisi differenziale, in Interpretazione dei risultati, selezionare il browser ID, aggiungere una libreria di strutture muropeptidiche previste e selezionare parametri simili come dimostrato per l'estrazione delle caratteristiche per produrre un'annotazione muropeptidica prevista per ogni caratteristica identificata. Per confermare manualmente l'annotazione del muropeptide prevista, confrontare i picchi del rapporto massa/carica del cromatogramma di spettrometria di massa tandem con il rapporto massa/carica previsto di tutte le possibili frammentazioni di una struttura murpeptidica nota.

Utilizzare un editor molecolare per disegnare la struttura del muropeptide prevista utilizzando lo strumento di frammentazione di massa per mostrare il rapporto massa-carica dei frammenti della spettrometria di massa quando ogni legame viene rotto singolarmente o in combinazione, quindi confrontare tutte le possibili frammentazioni della struttura del muropeptide con il cromatogramma tandem della spettrometria di massa. Per confermare l'annotazione del muropeptide, i picchi del rapporto massa/carica di più frammenti dovrebbero essere trovati nel cromatogramma di spettrometria di massa tandem con una finestra di allineamento del rapporto massa-carica molto minima. Per valutare i cambiamenti globali nelle modificazioni dei muropeptidi, modificare il file tsv dei muropeptidi ad alta variazione statisticamente significativi per includere una singola colonna per ogni modifica del muropeptide.

Compila questa colonna con una designazione per ogni muropeptide annotato e carica il file tsv modificato in Perseus. In Annota righe fare clic su Annota righe in modo categorico e aggiungere file di dati a ciascun parametro sperimentale. Quindi, durante il test, fare clic su due test di esempio per eseguire il test T di uno studente e fare clic su 1D per eseguire l'annotazione 1D.

Una maggiore sensibilità di rilevamento dei macchinari per spettrometria di massa, abbinata a un software di riconoscimento dei picchi ad alta potenza, ha migliorato la capacità di isolare, monitorare e analizzare le composizioni di sostanze di campioni complessi nei minimi dettagli. L'associazione di ogni picco massa-carica estratto dai dati della spettrometria di massa con un particolare muropeptide è facilitato dal cross-referencing con un database di strutture muropeptidiche note e previste. Il cromatogramma di spettrometria di massa tandem a frammentazione per ogni caratteristica estratta può essere confrontato con il profilo di frammentazione del muropeptide proposto utilizzando il database.

I grafici dei vulcani possono essere utilizzati per evidenziare i muropeptidi che dimostrano un'elevata variazione di abbondanza statisticamente significativa tra le condizioni testate. Se esaminati insieme, più muropeptidi che possiedono la stessa modifica possono essere esaminati per una tendenza verso una condizione sperimentale e l'intero gruppo può essere valutato per la significatività. Tracciare una modifica del muropeptide in questo modo può identificare una particolare attività enzimatica che è influenzata dal parametro sperimentale.

Inoltre, i valori anomali di questa tendenza possono rivelare attività enzimatiche con una particolare specificità o funzione biologica. Questa procedura esamina i cambiamenti biochimici e le variazioni biologiche nei polimeri, fornendo così informazioni sull'attività enzimatica che lavora sul PG in vivo. L'esame della composizione del PG nella verifica dei dettagli aiuterà nella comprensione delle strutture cellulari complesse che hanno implicazioni per molti processi fisiologici critici.