Dissezione assistita da transilluminazione di stadi specifici del ciclo epiteliale seminifero del topo per analisi immunosottenifere a valle

Questo metodo facilita l'identificazione e la dissezione di segmenti tubacei seminiferi specifici per stadio, consentendo lo studio di passaggi molto specifici della spermatogenesi. Gli stadi del ciclo epiteliale seminifero possono essere riconosciuti in tubuli freschi e non fissati e, quindi, possiamo selezionare solo gli stadi di interesse per le analisi a valle. Richiede un po' di pratica per imparare a riconoscere le fasi sulla base dei loro modelli di transilluminazione, ma questo protocollo dovrebbe garantire il tuo successo.

A dimostrare la procedura sarà Opeyemi Olotu, che è un dottorando nel mio laboratorio. Inizia mettendo un topo maschio adulto di almeno 8 settimane in posizione supina e disinfettando l'addome ventrale con etanolo al 70%. Usa le forbici sterili per praticare un'incisione a forma di V nella regione pelvica addominale e usa una pinza sterile per tirare il cuscinetto adiposo dell'epididimo per localizzare i testicoli.

Usa le forbici per sezionare i testicoli, posizionando i tessuti in una piastra di Petri sterile da 100 millimetri con PBS mentre vengono raccolti. Usa le forbici a punta fine per tagliare una fessura nella tunica albuginea, lo spesso foglio fibroso che incapsula i testicoli, e usa una pinza per aprire la tunica e forzare i tubuli fuori. Posizionare i tubuli seminiferi decapsulati in una nuova capsula di Petri e aggiungere abbastanza PBS sterile da coprire il fondo della capsula.

Quindi, usa la pinza per separare delicatamente i tubuli senza danneggiare i tessuti. Per la dissezione dei tubuli, fissare il piatto su un tavolino da microscopio da dissezione e attivare la transilluminazione. Usa una pinza fine per muovere con cura i fasci di tubuli per familiarizzare con l'assorbimento della luce e i modelli di dispersione dei diversi stadi.

Quindi, usa una pinza con una punta uncinata per sollevare un tubulo di interesse e usa le forbici da microdissezione per tagliare un segmento di una lunghezza appropriata. Dopo aver tagliato i segmenti del tubulo specifici dello stadio, utilizzare una pipetta per raccogliere un segmento di interesse in un volume di 10 microlitri di PBS e posizionare il segmento su un vetrino da microscopio. Premere con cautela un vetro di copertura di 20 x 20 millimetri sul tubulo senza schiacciare troppo le cellule e posizionare il vetrino sul tavolino di un microscopio a contrasto di fase.

Posizionare una carta da filtro sul bordo del vetro di copertura per facilitare la diffusione delle celle in un monostrato e utilizzare l'obiettivo 40 volte per verificare gli stadi delle celle. Una volta che le cellule hanno formato un monostrato rotondo da entrambe le estremità del tubulo, immergere il vetrino in un contenitore di azoto liquido per 10 secondi. Utilizzare un bisturi per staccare il vetro di copertura dalle celle e posizionare immediatamente il vetrino in etanolo al 90% per 2-5 minuti.

Quindi, asciugare all'aria e conservare il vetrino a temperatura ambiente per un massimo di diversi giorni. Per l'immunocolorazione a montaggio intero dei tubuli seminiferi, utilizzare una pipetta per trasferire i segmenti di interesse in una provetta conica da 15 millilitri di PBS ghiacciato su ghiaccio. Dopo aver lasciato sedimentare i segmenti, rimuovere con cura il PBS.

Aggiungere 10 millilitri di PBS fresco ghiacciato e mescolare per inversione. Lasciare riposare i tubuli per alcuni minuti prima di rimuovere nuovamente il surnatante come dimostrato. Quando tutto il surnatante è stato rimosso, fissare i tubuli in 5 millilitri di paraformaldeide per cinque ore a 20-30 giri al minuto a 4 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lasciare riposare i tubuli per alcuni minuti prima di lavare il campione tre volte in PBS fresco a 4 gradi Celsius per 10 minuti per lavaggio con rotazione. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta da 1 millilitro per trasferire da 10 a 20 segmenti di tubuli fissi in una provetta a fondo tondo da 2 millilitri. Quando i segmenti si sono stabilizzati, sostituire il surnatante con 1 millilitro di 2% BSA e 10% FBS in PBSX per un'ora di incubazione a temperatura ambiente e da 20 a 30 giri al minuto.

Al termine dell'incubazione bloccante, lavare i campioni con 1 millilitro di PBSX. Prima di etichettare i tubuli con 250 microlitri di anticorpo primario, diluirlo in 1%BSA in PBSX per due ore a temperatura ambiente a 20-30 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, lavare i tubuli tre volte in PBSX come dimostrato prima di marcare i campioni con 250 microlitri di anticorpi secondari appropriati per un'ora, al riparo dalla luce a temperatura ambiente e da 20 a 30 giri al minuto.

Al termine dell'incubazione, lavare i tubuli tre volte prima di travasare i tubuli su un vetrino da microscopio in un piccolo volume di surnatante. Quindi, utilizzare punte di caricamento del gel per disporre i tubuli in strisce lineari e drenare il tampone in eccesso. Quindi, aggiungere da 1 a 2 gocce di mezzo di montaggio prima di montare il vetrino con un vetrino coprioggetti.

In transilluminazione, gli stadi da 7 a 8 appaiono omogeneamente scuri perché contengono un numero elevato di spermatidi allunganti completamente condensati che sono allineati sulla superficie apicale dell'epitelio. Dopo che gli spermatozoi maturi sono stati rilasciati nel lume durante la spermiazione, il tubulo appare molto pallido negli stadi da 9 a 10 a causa dell'assenza di spermatidi allunganti condensati all'interno dell'epitelio. Questa zona pallida è seguita dalla zona della macchia debole, il cui aspetto macchiato ha origine dall'organizzazione di spermatidi allungati con cromatina condensata in fasci.

Questi fasci diventano molto prominenti nella successiva zona di strong spot. I fasci di spermatidi migrano verso i nuclei delle cellule del Sertoli che si trovano vicino alla lamina basale, che si riflette come un aspetto a strisce dei tubuli di stadio da 2 a 5 quando transilluminati. I fasci infine si disperdono allo stadio 6 e gli spermatidi allunganti condensati si avvicinano al lume per essere rilasciati dall'epitelio allo stadio 8.

Lo stadio esatto del segmento del tubulo può essere verificato con precisione mediante microscopia a contrasto di fase delle preparazioni di zucca. L'immunocolorazione di preparati di zucca a stadi può essere utilizzata per studiare l'espressione e la localizzazione di proteine di interesse nell'epitelio seminifero. La colorazione a montaggio intero del tubulo seminifero viene tipicamente utilizzata per studiare i tipi di cellule che sono in contatto con la membrana basale dell'epitelio seminifero, sia sul lato tubolare che interstiziale.

Il metodo può essere utilizzato anche per studiare cellule o strutture che si trovano più in profondità all'interno dell'epitelio, come la barriera emato-testicolare o le cellule germinali post-meiotiche. Oltre all'immunocolorazione, possiamo utilizzare segmenti tubarici di stadio per molte altre analisi a valle, tra cui saggi biochimici di RNA e proteine, citometria a flusso e coltura tubarica ex vivo. Poiché questo metodo consente un'analisi molto dettagliata della spermatogenesi, fornisce davvero uno strumento utile per studiare tutti i processi importanti necessari per la produzione di spermatozoi e la fertilità maschile.