Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta
21 febbraio 2021
Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.
Questo protocollo mostra due modi distinti di rilevare NKG2DL sulla superficie delle celle AML. La tecnica fornisce un metodo di colorazione veloce e intuitivo per rilevare tutti gli NKG2DL noti e possibilmente sconosciuti. Questo metodo consente la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML sfuse, il che consente di caratterizzare ulteriormente queste cellule.
Inizia scongelando la biotina e i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente. Far girare rapidamente la polvere NKG2D FC, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P-1000. Aggiungere 100 microlitri della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e mescolare accuratamente la soluzione con una micropipetta P-100.
Per scongelare le celle AML, rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarlo immediatamente in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente il mezzo e sciacquare il flaconcino utilizzando un millilitro di mezzo.
Centrifugare le cellule a 300 volte G per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le celle con cinque millilitri di mezzo RPMI contenente il 10%FCS e ripetere la centrifugazione. Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 per 10 alla settima cella per millilitro.
Quindi trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U 96 del pozzo e centrifugare la piastra a 300 volte G per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Preparare un mix master di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 microlitri per pozzo con una concentrazione finale di NKG2D di 10 microgrammi per millilitro per pozzo.
Aggiungere il master mix preparato e rimorsipare il pellet di cella con una pipetta da 200 microliter. Incubare e centrifugare la lastra come descritto nel manoscritto testuale. Preparare un master mix utilizzando streptavidina PE in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 microlitri.
Aggiungere il mix master alle celle e rimorsi il pellet con una pipetta multicanale da 300 microliter. Dopo aver centrifugato la piastra e scartato il supernatante, utilizzare una micropipetta multicanale da 300 microlitri per rimescolare i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone di colorazione più 7-AAD. Quindi analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.
I campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, con quattro diverse popolazioni in totale. La tipica strategia di gating inizia con la selezione della popolazione principale di cellule attraverso il loro FSC e SSC. Doppietti e cellule morte sono esclusi nell'analisi a valle.
I cancelli vengono regolati utilizzando i controlli FMO per garantire una corretta identificazione delle cellule positive. Le intensità di fluorescenza delle cellule positive per CD34 rispetto a NKG2DL sono evidenziate qui. Le cellule AML positive per CD34 mostrano una minore espressione superficiale di NKG2DL, che indica che l'espressione NKG2DL è associata alla mancanza di staminali.
Tre campioni di AML primari hanno dimostrato eventi positivi del 19,8, 49,8 e 89,4% per la colorazione delle proteine di fusione rispetto al 20,4, 50,4 e 90,6% per la colorazione degli anticorpi anti-NKG2DL in pool. D'altra parte, la colorazione del ligando singolo ha mostrato una serie di eventi positivi fino al 92% con percentuali variabili in base al ligando. Quando si tenta questo metodo, è molto importante essere veloci quando si scongelano le cellule AML primarie, perché sono fragili e possono morire facilmente durante questo passaggio.
Dopo aver eseguito questo protocollo, è possibile eseguire un ordinamento cellulare basato sul segnale NKG2DL per indagare ulteriormente le popolazioni.
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Panoramica
Questo protocollo presenta due metodi di colorazione distinti per la rilevazione dei ligandi di NKG2D (NKG2DLs) su campioni primari umani di leucemia mieloide acuta (AML). Le tecniche permettono la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML totali per una successiva caratterizzazione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oncologia
Sfondo
- I ligandi di NKG2D sono importanti per il riconoscimento immunitario nel cancro.
- La leucemia mieloide acuta (AML) presenta difficoltà nella caratterizzazione cellulare.
- I metodi attuali potrebbero non distinguere efficacemente le cellule staminali leucemiche.
- Nuovi protocolli di colorazione possono potenziare le capacità di rilevamento.
Scopo dello studio
- Sviluppare protocolli di colorazione efficienti per la rilevazione di NKG2DL.
- Facilitare la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML bulk.
- Migliorare la caratterizzazione dei campioni di AML.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una proteina fusa per riconoscere gli NKG2DL.
- Applicazione di diversi anticorpi anti-NKG2DL.
- Scongelamento e ricostituzione di biotina e proteina fusa NKG2D.
- Mescolamento delle soluzioni per ottenere le concentrazioni desiderate per la colorazione.
Risultati principali
- Entrambi i protocolli rilevano in modo efficace i NKG2DL noti e sconosciuti.
- Si ottiene la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML totali.
- I metodi sono semplici da usare e rapidi.
- È possibile un caratterizzazione migliorata delle cellule AML.
Conclusioni
- Nuovi protocolli di colorazione migliorano il rilevamento degli NKG2DL.
- Questi metodi possono contribuire alla comprensione della biologia della LMA.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su queste tecniche per ottenere spunti terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La distinzione tra cellule staminali leucemiche e popolazioni bulk di AML rimane una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi terapeutici e nello sviluppo di modelli preclinici. La capacità di isolare sottopopolazioni negative per NKG2DL dotate di proprietà staminali consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati ad ipotesi terapeutiche e sostiene la previsione affidabile nei flussi di scoperta precoce. Questo approccio orienta direttamente la selezione del portafoglio identificando sistemi rilevanti per la malattia con maggiore potenziale tumorigenico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando le cellule staminali leucemiche in base all'espressione superficiale di NKG2DL.
- Valore operativo: Fornisce un metodo rapido e di facile utilizzo per distinguere le sottopopolazioni con caratteristiche staminali dalle cellule AML differenziate.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale delle proprietà delle cellule staminali nelle frazioni negative per NKG2DL.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di citometria a flusso per confrontare l'espressione di NKG2DL tra approcci di marcatura specifici per ligando e pan-ligando.
- Valore operativo: Fornisce protocolli di marcatura riproducibili e standardizzati, compatibili con la preparazione per schermature ad alto rendimento.
- Valore scientifico: Permette la preparazione di sistemi biologici validati per schermature di composti successivi e studi sull'interazione con il bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori collegando la soppressione di NKG2DL ai meccanismi di evasioni immunitaria nelle LSC.
- Valore operativo: Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica consentendo l'isolamento di cellule iniziatrici della malattia.
- Valore scientifico: Migliora la capacità predittiva nei modelli preclinici utilizzando lo stato di NKG2DL per stratificare sottopopolazioni di LMA con potenziale tumorigenico differenziale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione e alla valutazione preclinica, consentendo l'isolamento di sottopopolazioni definite meccanicamente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi separando le LSC negative per NKG2DL dalle cellule AML positive per NKG2DL.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante una rilevazione superficiale standardizzata e quantitativa, compatibile con piattaforme di screening basate sulla citometria a flusso.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (percentuale di eventi positivi, intensità di fluorescenza), consentendo il confronto tra metodi di marcatura e frequenze di sottopopolazioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo l'isolamento delle LSC per la validazione funzionale in modelli rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'arricchimento delle cellule staminali, applicabile a diversi campioni di AML e adattabile ad altri tipi di cancro con meccanismi simili di evasionе immunitaria.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'arricchimento delle cellule staminali, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'identificazione delle cellule staminali leucemiche.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della rilevazione di NKG2DL in campioni multipli di LMA.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione nella validazione del bersaglio, efficienza del capitale grazie alla riduzione precoce dei rischi, riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per il rischio dei bersagli in base al potenziale di arricchimento delle cellule staminali leucemiche e al fenotipo di evasioni immunitaria.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in citometria a flusso, colorazione cellulare e manipolazione di campioni primari di LMA.
- È subordinato all'accesso a citofluorimetri, apparecchiature per la centrifugazione e reagenti quali biotina, proteina di fusione NKG2D, streptavidina PE e 7-AAD.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating, i controlli FMO e le impostazioni di compensazione, al fine di ottenere risultati coerenti.
- Richiede adattamenti quando applicato a diversi sistemi modello, a causa della variabilità nei profili di espressione dei ligandi di NKG2D.
- I limiti pratici includono la fragilità delle cellule primarie di LMA durante il scongelamento, che richiede un'elaborazione rapida per mantenere la vitalità cellulare.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
