Name: Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Impara due metodi citometrici a flusso per rilevare i ligandi NKG2D sulle cellule di leucemia mieloide acuta. Questa tecnica permette di separare le cellule staminali leucemiche dalle sottopopolazioni di massa per una caratterizzazione accurata.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (179239), della Fondazione per la lotta contro il cancro (Zuerich), della Fondazione Wilhelm Sander a CL (2019.042.1) e della Fondazione Novartis per la ricerca medico-biologica a C.L. Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 765104. Ringraziamo il Flow Cytometry Facility di Basilea per il supporto.

I campioni dei pazienti sono stati raccolti in seguito all'approvazione del Comitato di revisione etica degli ospedali universitari di Basilea e Tuebingen.
1. Biotinilazione della proteina di fusione NKG2D
NOTA: Questo passaggio viene eseguito con un kit di biotinylation (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Questa fase del protocollo deve essere eseguita almeno 24 ore prima della colorazione. La proteina di fusione NKG2D biotinilata deve essere conservata a -20 °C.
<ol><li>Scongelare sia la biotina, sia i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente (RT). NOTA: Se le cellule devono essere sterili per un ulteriore uso sperimentale (iniezione nei topi, test dell'unità di formazione della colonia, ecc.), ricostituire la proteina di fusione sotto una cappa di flusso laminare per evitare la contaminazione. Altrimenti, ogni passaggio può essere eseguito su una panchina.</li>
	<li>Spin down rapidamente i 50μg di proteina fusion NKG2D lëfilizzata. Aggiungere 500 μL di salina tamponata con fosfato (PBS) per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P1000.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale dello stock di 100 μg/mL.</li>
	<li>Mescolare accuratamente la soluzione mediante sospensione continua con una micropipetta P100.</li>
	<li>Incubare la soluzione di proteina di fusione/biotina in un RT controllato per 24 ore. La proteina da fusione è ora pronta all'uso.</li>
</ol>2. Scongelamento delle cellule AML primarie
NOTA: Circa 5.000.000 di cellule leucemiche congelate per paziente immagazzinate in azoto liquido sono state scongelate e quindi utilizzate immediatamente per i test. Le cellule leucemiche sono state ottenute e congelate come descrittoin precedenza 15. In breve, campioni di sangue periferico raccolti da pazienti con AML e alte percentuali di cellule esplosive (>90% di esplosioni tra cellule mononucleari) sono stati elaborati con una separazione del gradiente di densità per ottenere cellule mononucleari e successivamente congelati nel siero fetale del vitello (FCS) contenente soluzione di solfossido di dimetile al 10% (DMSO). Numeri cellulari molto variati tra i pazienti in dipendenza dalla concentrazione di leucociti nel paziente (range: da 1.000.000 a 30.000.000 di cellule leucemiche per mL sangue).
<ol><li>Mezzo RPMI pre-caldo contenente il 10% di FCS a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua. Per ogni flaconcino di celle AML (fino a 30.000.000 di celle in FCS da 1 ml + 10% DMSO), aggiungere 10 ml di mezzo preri riscaldato a un tubo di reazione da 15 ml.</li>
	<li>Rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e scongelare immediatamente le cellule utilizzando un bagno d'acqua a 37 °C. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio.</li>
	<li>Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente mezzi e sciacquare il flaconcino utilizzando 1 ml di mezzo.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Lavare le celle con 5 mL di mezzo RPMI contenente il 10% di FCS e centrifugare a 300 x g per 10 min.</li>
</ol>3. Conteggio delle celle
<ol><li>Rimondiva il pellet cellulare in un volume noto di mezzo RPMI contenente il 10% di FCS.</li>
	<li>Trasferire un piccolo volume della sospensione cellulare su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e diluire a un rapporto noto con trypan blu o qualsiasi altro colorante alternativo che consenta la discriminazione delle cellule vive / cellule morte.</li>
	<li>Utilizzare qualsiasi dispositivo per contare le celle.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
</ol>4. Colorazione di cellule AML primarie utilizzando la proteina di fusione NKG2D biotinilata
<ol><li>Preparare il tampone di colorazione integrando 500 mL PBS con albumina sierice bovina (BSA) e acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale rispettivamente di 0,07 mM e 2 mM. Regolare il pH (7.2–7.4) se necessario.</li>
	<li>Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 x 107 celle/mL. NOTA: Facoltativamente, prima della colorazione, le cellule possono essere incubate con un agente bloccante (ad esempio hIgG (1μg/ml) per 30 minuti presso l'agente bloccante RT o FcR)..</li>
	<li>Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in una piastra inferiore a U a 96 pozzetto e centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Preparare un master mix di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 μL per pozzo con una concentrazione finale di 10 μg/mL per pozzo.</li>
	<li>Aggiungere la miscela master preparata al passaggio 4.4 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL. NOTA: Ridimensionare il volume finale in base al numero di cellule per ridurre la quantità di proteina da fusione necessaria per la colorazione.</li>
	<li>Incubare la sospensione cellulare per 25 minuti a RT o 50 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo con una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.7 e 4.8. NOTA: La colorazione qui descritta viene eseguita in una piastra inferiore a U a 96 po 'di coltura cellulare. Pertanto, i passaggi di lavaggio vengono eseguiti due volte a causa della piccola capacità di volume di tali piastre. La colorazione può essere eseguita anche in altri tubi e le fasi di lavaggio potrebbero quindi essere eseguite una sola volta utilizzando un volume maggiore.</li>
	<li>Preparare una miscela master utilizzando Streptavidin-PE (vedi tabella 1 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL. NOTA: Aggiungi anticorpi di selezione per il tuo tipo di interesse cellulare come ad esempio CD33, CD34.... per AML.</li>
	<li>Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 4.10 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Incubare le sospensioni cellulari per 15 minuti a RT o 30 minuti a 4 °C al buio.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo con una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.13 e 4.14.</li>
	<li>Preparare una soluzione di tampone di colorazione tra cui 7-AAD (7-aminoactinomicina D, 1:1000) o qualsiasi reagente per distinguere tra cellule vive e morte.</li>
	<li>Pellet di cellule resuspend in tampone di colorazione da 200 μL + 7-AAD preparato nella fase 4.16 utilizzando una micropipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Analizzare le celle utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.</li>
</ol>5. Colorazione di anticorpi anti-NKG2DL singoli o raggruppati
<ol><li>Utilizzare la stessa sospensione cellulare del passaggio 4.2.</li>
	<li>Trasferire 100 μL della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U a 96 pozzetto di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL e centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Preparare una miscela di anticorpi per ciascun anticorpo primario o anticorpi raggruppati (vedi tabella 2 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL.</li>
	<li>Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 5.3 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Incubare le cellule per 25 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Centrifugare la piastra inferiore a U a 96 pozzi a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.6 e 5.7.</li>
	<li>Preparare una miscela di maestri anticorpi aggiungendo l'anticorpo secondario (vedi tabella 2 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL per pozzo.</li>
	<li>Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 5.9 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Incubare per 15 minuti a RT o 30 minuti a 4 °C al buio.</li>
	<li>Lavare aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.12 e 5.13.</li>
	<li>Pellet di cellule resuspend in tampone di colorazione da 200 μL contenente 7-AAD preparato nella fase 4.16.</li>
	<li>Analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso come descritto nel passaggio 6.</li>
</ol>6. Acquisizione dei dati
NOTA: Assicurarsi che vengano eseguiti controlli di qualità settimanali del citometro di flusso per garantire che i laser funzionino correttamente. Per il protocollo qui presentato, viene eseguito un processo settimanale di citometro e tracciamento (CTS) con perline relative per controllare le prestazioni laser su tutti i canali. Dopo il CTS, vengono registrati 10.000 eventi utilizzando le perline a 8 picchi come controllo interno. Tutti i picchi dovrebbero essere nella stessa posizione all'interno dei loro cancelli e ben separati l'uno dall'altro.
<ol><li>Create la compensazione della matrice per sottrarre sovrapposizioni spettrali tra rivelatori con perline o con celle16.</li>
	<li>Registra 10.000 eventi per le celle non macchiate e le singole perline macchiate. Per i controlli fluorescenza meno uno (FMO), registrare 50.000 eventi e per i campioni macchiati record fino a 100.000 eventi. NOTA: In alternativa, è possibile eseguire singoli campioni macchiati sulle celle. In tal caso, assicurarsi che le celle abbiano un segnale positivo per il marcatore desiderato.</li>
	<li>Acquisire una singola cella macchiata o un campione di perline per ogni fluoroforo utilizzato nell'esperimento per rivelare la quantità di sovrapposizione spettrale. Utilizzare il creatore di compensazioni del dispositivo di citometria del flusso per calcolare i valori di spill-over e applicare la matrice di compensazione a tutti i campioni misurati. NOTA: Gli anticorpi secondari non possono essere utilizzati per la creazione di compensazioni utilizzando perline se la compensazione è calcolata con perline. A seconda del tipo di perline di compensazione, gli anticorpi secondari non possono essere utilizzati per la compensazione con perline.</li>
	<li>Per i controlli FMO e i campioni macchiati completi con la proteina di fusione, in primo luogo, selezionare le cellule in base alla loro dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC). Dopo l'esclusione dei farsa, gate le cellule in base alla loro negatività per il segnale 7-AAD (PercP-Cy5.5) per escludere le cellule morte (vedi passaggio 5.15). Il grafico finale mostra l'espressione di CD34 (asse Y) e NKG2DL (asse X) su singoletti viventi.</li>
	<li>Per i singoli anticorpi anti-NKG2DL, applicare la stessa strategia ai campioni, ma si noti che la positività del ligando risiede in Alexa Fluor 488 e non nel canale PE.</li>
	<li>Regolare i cancelli in base ai comandi FMO per la strategia di gating dai punti 6.4 e 6.5 (vedi tabella 3) per i controlli FMO appropriati da eseguire per questo esperimento: nel software di analisi, disegnare un cancello sulla frazione negativa. Durante la registrazione del campione macchiato completo, le celle sopra il cancello creato in precedenza sono positive per il marcatore analizzato.</li>
</ol>

<ol><li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger.</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Campbell, K. S., Hasegawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+biology%3A+an+update+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell biology: an update and future directions.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331 (6013), 44-49 (2011).</li>
<li>Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D%3A+A+master+regulator+of+immune+cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness.</a> Frontiers in Immunology. 9, 441(2018).</li>
<li>Zingoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+and+its+ligands%3A+%22One+for+All%2C+All+for+One%22%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NKG2D and its ligands: "One for All, All for One".</a> Frontiers in Immunology. 9, 476(2018).</li>
<li>Eagle, R. A., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuity+and+the+single+receptor%3A+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promiscuity and the single receptor: NKG2D.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).</li>
<li>El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+and+conflicting+roles+of+the+human+NKG2D+lymphocyte+receptor+and+its+ligands+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).</li>
<li>Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+region+architecture+and+transcriptional+regulation+of+the+genes+for+the+MHC+class+I-related+chain+A+and+B+ligands+of+NKG2D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D.</a> Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+signaling+by+inhibitory+receptors%3A+the+NK+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm.</a> Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).</li>
<li>Hüe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+NKG2D%2FMICA+interaction+in+villous+atrophy+during+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.</a> Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).</li>
<li>Gasser, S., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activation and self-tolerance of natural killer cells.</a> Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).</li>
<li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stress-regulated+human+major+histocompatibility+complex+class+I+gene+expressed+in+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).</li>
<li>Maurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+shedding+of+NKG2D+ligands+impairs+NK+cell+immune-surveillance+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1364827(2018).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+NKG2D+ligands+defines+leukaemia+stem+cells+and+mediates+their+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion.</a> Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).</li>
<li>Paczulla, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+observation+reveals+high-frequency+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice.</a> Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Taussig, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+from+some+acute+myeloid+leukemia+patients+with+mutated+nucleophosmin+reside+in+the+CD34%28-%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction.</a> Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).</li>
<li>Zhou, J., Chng, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+targeting+leukemia+stem+cells%3A+the+path+to+the+cure+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia.</a> World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui presentiamo due metodi citometrici a flusso in grado di rilevare l'espressione di superficie NKG2DL sulle cellule AML primarie umane. Mostriamo che entrambi i metodi di rilevamento possono essere utilizzati in combinazione con altre colorazioni anticorpali (ad esempio, rilevando l'espressione CD34). Colorazioni simili possono essere eseguite anche su altri tipi di cellule primarie e linee cellulari.
Di recente abbiamo dimostrato che l'assenza di NKG2DL sulla superficie delle esplosioni del...

Le cellule NK sono importanti effettori del sistema immunitario innato in grado di riconoscere ed eliminare le cellule maligne o le cellule sane stressate (ad esempio, da un'infezione virale) senza previo stimolo dell'antigene1. Questo processo è strettamente regolato attraverso un complesso repertorio di recettori attivanti - come recettori naturali della citotossicità (NCR), NKG2D e CD16 - e recettori inibitori che sono in gran parte rappresentati da recettori killer simili a immunoglobuline (KIR)2. Il legame dei KIR con le molecole umane di antigene leucocitare (HLA) di classe I su cellule somatiche garantisce l'auto-riconoscimento e trasmette la tolleranza cellulare NK. D'altra parte, l'assenza di auto-riconoscimento e l'aumento del legame dei recettori attivanti ai loro ligandi sulle cellule bersaglio innescano il rilascio di granuli citotossici che portano alla citotossicità mediata dalle cellule NK1. Infine, le cellule NK possono esercitare citotossicità cellulare dipendente dagli anticorpi (ADCC) legando il recettore di attivazione CD16 a bersagli che esprimono la porzione Fc di Ig (FcR)2. Oltre alla citotossicità diretta, le cellule NK possono anche innescare il rilascio di citochine che collega l'innato con il sistema immunitario adattivo3.
NKG2D è un importante recettore attivante espresso su cellule NK, NKT, γδ T e INgenua CD8+ T4 che consente a tali cellule immunitarie citotossiche di riconoscere e lisciviare il ligando NKG2D (NKG2DL) che esprime le cellule bersaglio. Le cellule sane comunemente non esprimono NKG2DL. Invece, l'espressione NKG2DL è upregolata su cellule maligne o infettate da virus per renderle suscettibili al nulla osta immunitario5.
La famiglia umana NKG2DL comprende otto molecole conosciute tra cui le due molecole A e B correlate alla catena MHC I (MICA e MICB6)e le proteine leganti ul16 del citomegalovirus 1-6 (ULBP1-67). L'espressione di NKG2DL è regolata sui livelli trascrizionale, post-trascrizionale e post-traslazione8. Come tale, mentre l'espressione NKG2DL non è comunemente rilevabile sulla superficie di cellule sane, NKG2DL mRNA9 ed espressione proteica intracellulare sono stati riportati nei tessuti sani. La rilevanza funzionale di tale espressione e i meccanismi alla base di tali modelli di espressione discrepant devono ancora esseredefiniti 10.
La regolazione meccanicistica dell'espressione NKG2DL nelle cellule tumorali è un'affascinante area di indagine. Le vie note per essere coinvolte nello stress cellulare, ad esempio la via di stress da shocktermico 9,o le vie associate al danno al DNA, come l'atassia telangiectasia mutata (ATM) e la via11correlata a Rad3 (ATR), così come le infezioni virali o batteriche sono state direttamente collegate all'induzione dell'espressione NKG2DL12. Tuttavia, anche se l'espressione superficiale di NKG2DL è stata efficacemente indotta, questa espressione può essere persa di nuovo attraverso lo spargimento mediato proteoliticamente, un meccanismo associato alla fuga immunitaria e alla scarsa prognosi clinica in alcuni tumori13.
L'assenza di superficie cellulare NKG2DL può anche svolgere ruoli importanti nei pazienti con AML. Qui, il trattamento con chemioterapia intensiva spesso induce remissione, ma la ricaduta si verifica spesso da cellule staminali leucemiche (LSC), che sopravvivono selettivamente alle chemioterapie ed eludono la risposta immunitaria. Come abbiamo dimostrato di recente, gli LSC, ad esempio, sfuggono alla lisi cellulare NK sopprimendo l'espressione di superficie NKG2DL14.
Inversamente, l'assenza di espressione di NKG2DL superficiale può essere utilizzata come metodo per identificare e isolare vibilmente sottopopolazioni putative simili a staminali di cellule dalle sottopopolazioni leucemiche di controparte sfusa. Qui, presentiamo due approcci citometrici a flusso che possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale NKG2DL e quindi identificare le cellule staminali negative NKG2DL nella leucemia e forse anche in altri tumori: un metodo per il riconoscimento della superficie pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi singoli o raggruppati che riconoscono singole proteine NKG2DL conosciute.

<table><tbody><tr><td>7-amminoactinomicina D (7-AAD)</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>Colorante di vitalità</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti Fondo a U</td><td>Sarstedt</td><td>833925500</td><td>Piastra a 96 pozzetti per il nostro citometro a flusso</td></tr><tr><td>APC Topo Anti-umano cd34</td><td>BD</td><td></td><td>555824 Anticorpo che rileva CD34 RRID: AB_398614</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1391,0050</td><td>Componente della colorazione tampone</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td>Componente del tampone di colorazione</td></tr><tr><td>Fetale Siero di vitello (FCS)</td><td>BioConcept</td><td>2-01F10-I</td><td>Componente del mezzo RPMI integrato</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>BD</td><td>/</td><td>Software che consente l'analisi dei dati per l'esperimento di citometria a flusso</td></tr><tr><td>IgG di capra anti-coniglio (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21222</td><td>Anticorpo secondario che rileva gli anticorpi primari per MICA e MICB RRID: AB_1037853</td></tr><tr><td>Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td><td>R& D</td><td>1299-NK-050</td><td>Proteina di fusione che rileva tutti gli NKG2DL RRID:</td></tr><tr><td>R</td><td>& D</td><td>AF1380</td><td>Anticorpo che rileva ULBP1 RRID: AB_354765</td></tr><tr><td>Umano ULBP-2/5/6 Anticorpo</td><td>R& D</td><td>AF1298</td><td>Anticorpo che rileva ULBP2/5/6 RRID:</td></tr><tr><td>AB_354725 Anticorpo umano ULBP-3</td><td>R& D</td><td>AF1517</td><td>Anticorpo di rilevamento ULBP3 RRID:</td></tr><tr><td>AB_354835 MICA Anticorpo policlonale</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-35346</td><td>Anticorpo di rilevamento MICA RRID: AB_2552656</td></tr><tr><td>MICB Anticorpo policlonale</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-66698</td><td>Anticorpo di rilevamento MICB RRID: AB_2663413</td></tr><tr><td>Kit di biotinilazione anticorpale in un'unica fase 1 striscia, per 8 reazioni</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-093-385</td><td>Kit di biotinilazione per la proteina di fusione NKG2DL</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Componente del tampone di colorazione</td></tr><tr><td>Coniglio anti-capra IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticorpo secondario che rileva gli anticorpi primari per ULBPs RRID: AB_2576217</td></tr><tr><td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um</td><td>Spherotech Inc.</td><td>RCP-30-20A</td><td>Perle utilizzate per la manutenzione del dispositivo di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Mezzo RPMI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>RayBright Perle di compensazione universale Raybiotech</td><td></td><td>137-00013-100</td><td>Perle utilizzate per creare la matrice di compensazione</td></tr><tr><td>Streptavidina, R-Ficoeritrina coniugato (SAPE) - 1 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>S866</td><td>Fase secondaria per la rilevazione della proteina di fusione NKG2DL biotinilata</td></tr></tbody></table>

due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando nkg2d per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

All'interno dello stesso paziente, l'assenza di espressione superficiale dei ligandi NKG2D (NKG2DL) ha dimostrato di distinguere le sottopopolazioni leucemiche con proprietà delle cellule staminali (le cosiddette cellule staminali leucemiche, LSC) da cellule leucemiche di controparte più differenziate che mancano di potenziale di iniziazione della malattia sebbene portino mutazioni genetiche specifiche della leucemia simili. Gli NKG2DL sono auto-molecole simili a MHC di classe I, biochimicamente molto diverse. Le cellule sane in condizioni omeostatiche generalmente non esprimono NKG2DL sulla superficie cellulare. Invece, l'espressione di questi ligandi è indotta dall'esposizione allo stress cellulare (ad esempio, trasformazione oncogenica o stimoli infettivi) per innescare l'eliminazione delle cellule danneggiate attraverso lalisi attraverso cellule immunitarie che esprimono il recettore NKG2D come le cellule natural killer (NK). È interessante notare che l'espressione superficiale di NKG2DL viene soppressa selettivamente nelle sottopopolazioni LSC, consentendo a queste cellule di eludere la sorveglianza immunitaria mediata da NKG2D. Qui, presentiamo un'analisi affiancata di due diversi metodi di citometria a flusso che consentono lo studio dell'espressione superficiale di NKG2DL sulle cellule tumorali, cioè un metodo che prevede il riconoscimento del pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi multipli contro singoli ligandi. Questi metodi possono essere utilizzati per separare le sottopopolazioni cellulari negative NKG2DL vitali con proprietà putative delle cellule staminali tumorali dal NKG2DL positivo non LSC.

Entrambi i protocolli qui presentati consentono l'arricchimento di AML LSC mediante analisi citometriche di flusso utilizzando CD34, un marcatore noto di LSC17, in combinazione con l'espressione superficiale NKG2DL utilizzando il riconoscimento pan-ligando o macchiando con anticorpi raggruppati contro singoli ligandi. Nella figura 1, mostriamo che i campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, che è mostrata ...

Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Questo protocollo mostra due modi distinti di rilevare NKG2DL sulla superficie delle celle AML. La tecnica fornisce un metodo di colorazione veloce e intuitivo per rilevare tutti gli NKG2DL noti e possibilmente sconosciuti. Questo metodo consente la separazione delle cellule staminali leucemiche dalle cellule AML sfuse, il che consente di caratterizzare ulteriormente queste cellule.Inizia scongelando la biotina e i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente. Far girare rapidamente la polvere NKG2D FC, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P-1000. Aggiungere 100 microlitri della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e mescolare accuratamente la soluzione con una micropipetta P-100.Per scongelare le celle AML, rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarlo immediatamente in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente il mezzo e sciacquare il flaconcino utilizzando un millilitro di mezzo.Centrifugare le cellule a 300 volte G per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le celle con cinque millilitri di mezzo RPMI contenente il 10%FCS e ripetere la centrifugazione. Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 per 10 alla settima cella per millilitro.Quindi trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U 96 del pozzo e centrifugare la piastra a 300 volte G per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Preparare un mix master di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 microlitri per pozzo con una concentrazione finale di NKG2D di 10 microgrammi per millilitro per pozzo.Aggiungere il master mix preparato e rimorsipare il pellet di cella con una pipetta da 200 microliter. Incubare e centrifugare la lastra come descritto nel manoscritto testuale. Preparare un master mix utilizzando streptavidina PE in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 microlitri.Aggiungere il mix master alle celle e rimorsi il pellet con una pipetta multicanale da 300 microliter. Dopo aver centrifugato la piastra e scartato il supernatante, utilizzare una micropipetta multicanale da 300 microlitri per rimescolare i pellet cellulari in 200 microlitri di tampone di colorazione più 7-AAD. Quindi analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.I campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, con quattro diverse popolazioni in totale. La tipica strategia di gating inizia con la selezione della popolazione principale di cellule attraverso il loro FSC e SSC. Doppietti e cellule morte sono esclusi nell'analisi a valle.I cancelli vengono regolati utilizzando i controlli FMO per garantire una corretta identificazione delle cellule positive. Le intensità di fluorescenza delle cellule positive per CD34 rispetto a NKG2DL sono evidenziate qui. Le cellule AML positive per CD34 mostrano una minore espressione superficiale di NKG2DL, che indica che l'espressione NKG2DL è associata alla mancanza di staminali.Tre campioni di AML primari hanno dimostrato eventi positivi del 19,8, 49,8 e 89,4% per la colorazione delle proteine di fusione rispetto al 20,4, 50,4 e 90,6% per la colorazione degli anticorpi anti-NKG2DL in pool. D'altra parte, la colorazione del ligando singolo ha mostrato una serie di eventi positivi fino al 92% con percentuali variabili in base al ligando. Quando si tenta questo metodo, è molto importante essere veloci quando si scongelano le cellule AML primarie, perché sono fragili e possono morire facilmente durante questo passaggio.Dopo aver eseguito questo protocollo, è possibile eseguire un ordinamento cellulare basato sul segnale NKG2DL per indagare ulteriormente le popolazioni.

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Forniamo una descrizione dettagliata di un protocollo per l'analisi citofluorimetrica di antigeni di superficie e/o antigeni intracellulari in tipi di cellule neurali. Vengono spiegati gli aspetti critici della pianificazione sperimentale, le procedure metodologiche passo-passo e i principi fondamentali della citometria a flusso al fine di consentire ai neurobiologi di sfruttare questa potente tecnologia.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Impara due metodi citometrici a flusso per rilevare i ligandi NKG2D sulle cellule di leucemia mieloide acuta. Questa tecnica permette di separare le cellule staminali leucemiche dalle sottopopolazioni di massa per una caratterizzazione accurata.

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta (Video) | JoVE Journal

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

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