Name: Utilizzo dellanalisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri un metodo di analisi delle immagini con Fiji-ImageJ per quantificare le metastasi polmonari nel modello 4T1 di cancro al seno. Questa tecnica riduce gli errori umani e fornisce risultati più rapidi e coerenti per la ricerca preclinica.

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Questo lavoro è stato supportato dal Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), dal Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) e dai National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Virginia Tech e in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L'esecuzione di questo protocollo richiede l'autorizzazione delle istituzioni appropriate e il rispetto di tutte le linee guida appropriate.
1. Coltura cellulare
<ol><li>Crea supporti di coltura completi (RPMI + 10% siero bovino fetale +1% Pen Strep). Ravvivare le cellule 4T1 secondo il protocollo ATCC10 e incubare a 37 °C e al 5% di CO2 in un pallone T-25 fino a confluenza. Cambiare il supporto il giorno dopo la riavivizione per rimuovere le celle morte e di nuovo se il supporto viene speso prima che le celle siano abbastanza confluenti da passare.</li>
	<li>Una volta che il pallone T-25 è confluente, passare le cellule in un pallone T-75 scartando il supporto, lavare il pallone con 5 ml di 1x dulbecco di dulbecco tamponato salino tamponato (DPBS), e aggiungendo 500 μL di Tripsina-EDTA. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano.<ol>
<li>Una volta staccato, aggiungere 5 mL di mezzi di coltura completi riscaldati alle cellule. Aspirare e trasferire i 5 mL in un pallone T-75 contenente 15 ml di mezzi di coltura completi riscaldati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di passaggio in flaconi T-75 almeno quattro volte. Eseguire questa operazioni una volta che il pallone è confluente lavando con 8 ml di 1x DPBS, aggiungendo 1 ml di Tripside-EDTA per staccare le cellule, aggiungendo 10 ml di mezzi riscaldati alle cellule e diluendo 1:6-1:8 in un nuovo pallone T-75 contenente 20 ml di mezzi di coltura completi riscaldati.</li>
	<li>Cellule di passaggio fino al numero appropriato di mastri T-150 contenenti 40 mL di mezzi di coltura completi riscaldati per il numero di topi da iniettare. La maggior parte degli studi richiederà più flaconi T-150 per garantire abbastanza cellule per l'iniezione.</li>
	<li>Quando i topi sono pronti per essere iniettati (8 settimane o di peso superiore a 20 g, a seconda della IACUC o dei protocolli istituzionali), raccogliere le cellule scartando i mezzi, lavando ogni pallone con 10 ml di 1x DPBS e aggiungendo 2 ml di tripside-EDTA. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano.</li>
	<li>Lavare il pallone con 10 ml di supporto completo e trasferire tutto il contenuto (10 ml di supporti + 2 ml di miscela di cellule tripside-EDTA) nel pallone successivo. Continuare a lavare e raccogliere le cellule da ogni pallone utilizzando gli stessi 10 ml di supporti per evitare l'uso di una quantità eccessiva di supporti.<ol>
<li>Una volta raccolti tutti i contenitori, trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga da 50 ml. Raccogliere un campione da 10 μL per il conteggio in un tubo di microcentrifugo e centrifugare il tubo conico da 50 ml a 125 x g per 5 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mentre le cellule vengono centrifugate, aggiungere 10 μL di tripano blu a 10 μL di campione cellulare. Contare le cellule usando un emocitometro. Una volta determinato il numero totale di cellule, calcolare la concentrazione di cellule necessarie per iniettare topi per 1,2 x 106 cellule per topo (per 100 μL).</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, i mezzi decantati e il pellet di cellule resuspend nella corretta quantità di DPBS sterile 1x per 1,2 x 106 cellule per 100 μL. Miscela split cell/DPBS in tubi a microcentrifugo per un facile accesso con la siringa durante l'aspirazione di cellule per iniezione. Tenere le cellule sul ghiaccio e iniettare poco dopo quando le cellule inizieranno a morire dopo essere state sul ghiaccio per lunghi periodi di tempo.</li>
</ol>2. Iniezioni
<ol><li>Preparare le cellule per l'iniezione toccando o mescolando delicatamente il tubo di microcentrifugo per rimescolare le cellule, quindi aspirare 600 μL in una siringa da 1 ml. Ruotare la siringa verso l'alto e tirare lo stantuffo verso il basso per allontanare le cellule dall'apertura della siringa. Toccare la siringa per liberarla dalle bolle d'aria.</li>
	<li>Attaccare l'ago smussare e erogare le cellule nel tubo di microcentrifugo fino a quando nella siringa rimangono solo 500 μL. Metti la siringa piatta sul ghiaccio. NOTA: le cellule 4T1 cadono rapidamente dalla sospensione. Pertanto, è importante mescolare le cellule in sospensione toccando frequentemente.</li>
	<li>Anestetizzare il topo BALB/c femmina di 8 settimane/>20 g utilizzando isoflurane o altro agente anestetico approvato. Monitorare la respirazione del topo per valutare la profondità dell'anestesia.</li>
	<li>Una volta che il mouse è correttamente anestetizzato come indicato dalla mancanza di riflesso corneale, posizionare il mouse sulla schiena. Usando il pollice, il puntatore e il dito medio, tenere premuto delicatamente il mouse. Usa il puntatore e le dita centrali per tenere premuto la parte superiore del corpo e il pollice del mouse per la gamba sinistra posteriore. Sii gentile ma fermo.</li>
	<li>Con la smussatura dell'ago in su, iniettare 100 μL di cellule per via sottocutanea nel cuscinetto grasso mammario addominale sinistro del topo. Monitorare per una buona benda e qualsiasi perdita, e assicurarsi che il mouse si svegli e si muova facilmente dopo l'iniezione.<ol>
<li>Cambiare gli aghi tra ogni mouse. NOTA: Non lasciare che l'ago entri nella cavità peritoneale. Ciò causerebbe una rapida diffusione del cancro e non rappresentativo del modello. Per garantire un'iniezione sottocutanea, tirare delicatamente verso l'alto sull'ago quando inserito nel cuscinetto grasso mammario addominale sinistro. Se l'ago viene facilmente sollevato verso l'alto, è posizionato correttamente per via sottocutanea.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Monitoraggio
<ol><li>Monitora i topi almeno 3 volte a settimana per peso, punteggio delle condizioni corporee, dimensione del tumore, condizione tumorale, respirazione, livello di attività, aspetto e movimento. Una volta che il tumore raggiunge 0,7-0,8 cm di diametro, inizia a monitorare ogni giorno.<ol>
<li>Considera l'eutanasia quando la dimensione del tumore raggiunge 1,5 cm, o la perdita di peso raggiunge il 20%, o il grave declino clinico del punteggio delle condizioni del corpo, le condizioni tumorali, la respirazione, il livello di attività, l'aspetto o il movimento sono osservati sulla base delle linee guida istituzionali. NOTA: Il punteggio delle condizioni del corpo è fondamentale da monitorare poiché il peso corporeo può aumentare con l'aumentare delle dimensioni del tumore, negando la perdita delle condizioni del corpo a causa del peso della malattia. I protocolli di monitoraggio esatti dipenderanno dall'IACUC approvato o dai protocolli istituzionali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Necropsia
<ol><li>Eutanasia del mouse utilizzando co2 seguendo le linee guida istituzionali.</li>
	<li>Spruzzare il topo con il 70% di etanolo per disinfettare. Fai un'incisione sulla linea mediana ventrale del mouse per esporre la cavità corporea.</li>
	<li>Rimuovere il rene. Continuare a tagliare la linea mediana fino a quando il diaframma non è visibile. Usa le forbici per forare il diaframma per sgonfiare i polmoni. Tagliare il diaframma per ottenere un migliore accesso alla cavità.</li>
	<li>Usa forbici smussate per tagliare il centro della gabbia toracica. Pin ribcage indietro per esporre il polmone e il cuore.</li>
	<li>Perfondere il cuore con 2 mL di 1x DPBS non sterile inserendo un ago nell'apice del cuore fino a quando non si incunea nella cavità addominale in cui il rene è stato rimosso.</li>
	<li>Per rimuovere il cuore e i polmoni, utilizzare forbici smussate per tagliare l'esofago e la trachea direttamente sopra il cuore. Usando le forcelle, inizia a allontanare il cuore dal corpo e taglialo via a qualsiasi tessuto connettivo tenendolo attaccato. I polmoni escono con il cuore.</li>
	<li>Identificare i polmoni multi-lobato (destra) e monolobato (sinistra). Tenere il cuore attaccato per riferimento, ma una volta identificati i polmoni, tagliare il cuore.</li>
	<li>Etichettare una piastra di 12 polacche contenente 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) in ogni pozzo. Ogni topo ha bisogno di 2 pozzi. Posizionare il polmone multi-lobato (a destra) nella piastra del pozzo 12 per la valutazione della metastasi e tenere sul ghiaccio. Tieni il vicino ben vuoto per ora. NOTA: È importante utilizzare lo stesso polmone (multi-lobato) da ogni mouse per assicurarsi che ogni campione sia di dimensioni vicine. Il polmone a lobato singolo può quindi essere usato per altre analisi, come l'istopatologia. NOTA: I campioni sono stabili sul ghiaccio o a 4 °C per alcune ore.</li>
</ol>5. Lavorazione dei tessuti
NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione devono essere eseguiti con tecnica sterile.
<ol><li>Etichettare 1 tubo conico da 15 ml per topo e aggiungere 2,5 ml di miscela di collagenasi di tipo IV e 30 unità di elastasi a ciascun tubo. Per fare la miscela di collagenasi di tipo IV, sciogliere 2 mg di collagenasi di tipo IV per mL 1x HBSS e filtro sterile. Questo può essere conservato fino a 12 mesi a -20 °C e scongelato quando necessario.</li>
	<li>Trasferire il polmone al secondo, pulire bene 1x HBSS per quel campione. Ruotare usando le forcep per rimuovere il sangue rimanente. Trasferire il polmone pulito nella piastra di coltura tissutale vuota da 3,5 cm. Polmone tritare con forbici. Risciacquare la piastra con 2,5 ml di 1 HBSS, trasferire 1x HBSS e pezzi polmonari in un tubo conico da 15 ml già contenente collagenasi/elastasi cocktail (5 mL totali).</li>
	<li>Incubare per 75 minuti a 4 °C. Continuare a mescolare i campioni durante questo periodo, quindi posizionare i tubi su un rocker o una ruota rotante. Durante questa fase di incubazione, etichettare i tubi di centrifuga da 50 ml e le piastre di coltura tissutale da 10 cm per ogni topo. Se si fa una diluizione, etichettare abbastanza piastre di coltura tissutale da 10 cm per le diluizioni. NOTA: Etichettare il coperchio delle piastre di coltura tissutale. Se si etichetta la piastra stessa, la scrittura interferirà con l'analisi Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Portare il volume di ogni tubo fino a 10 mL totali con 1 HBSS. Versare il contenuto su un colino cellulare di 70 μm in un tubo conico da 50 ml per ciascun campione. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 ml per macinare delicatamente il campione attraverso il filtro per consentire a più cellule di filtrare.</li>
	<li>Centrifuga per 5 minuti a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatante e lavare il pellet con 10 mL di 1x HBSS. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
	<li>Resuspend pellet in 10 mL di 60 μM 6TG supporti di coltura completi, RPMI o IMDM. Campioni di piastre in piastre di coltura cellulare di 10 cm, utilizzando uno schema di diluizione, se lo si desidera. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 5 giorni. NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 sono diluizioni comuni che dovranno essere determinate empiricamente in base ai parametri di studio. ATTENZIONE: 6TG è tossico. Prestare attenzione durante la manipolazione e seguire tutte le linee guida per la salute e la sicurezza ambientale per lo smaltimento.</li>
</ol>6. Piastre di colorazione
<ol><li>Versare i supporti di coltura dalle piastre in un contenitore di rifiuti appropriato. Fissare le cellule aggiungendo 5 mL di metanolo non diluito per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di ruotare il metanolo in modo che copra l'intera piastra. ATTENZIONE: Il metanolo è pericoloso se ingerito, inalato o sulla pelle. Utilizzare una cappa aspirante per questo passaggio.</li>
	<li>Versare il metanolo dalle piastre in un contenitore di rifiuti appropriato. Risciacquare le piastre con 5 mL di acqua distillata per piastra e versare acqua in un contenitore di rifiuti appropriato. Aggiungere 5 mL di blu di metilene allo 0,03% per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di ruotare la soluzione blu di metilene in modo che copra l'intera piastra.</li>
	<li>Versare il blu di metilene in un contenitore di rifiuti appropriato. Risciacquare nuovamente le piastre con 5 mL di acqua distillata per piastra. Capovolgere le piastre e tamponare contro un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra sul coperchio e lasciare asciugare l'aria durante la notte a RT. NOTA: Le colonie metastatiche saranno blu. Una volta asciugati, i piatti possono essere conservati a RT a tempo indeterminato.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini
<ol><li>Rimuovere i coperchi etichettati dalle piastre, facendo attenzione a garantire una chiara identificazione dei campioni. Allinea tutte le piastre polmonari macchiate su una superficie pulita e leggera per scattare una foto di tutte le piastre in un'unica immagine.</li>
	<li>Scatta una foto della collezione di piatti in un'area ben illuminata, assicurandoti di ridurre al minimo i riflessi poiché le piastre sono molto riflettenti. I riflessi nelle lastre influenzeranno l'analisi delle immagini e quindi dovranno essere evitati. NOTA: Fiji-ImageJ ha un limite superiore di 2 gigapixel. La maggior parte degli smartphone moderni avrà fotocamere sufficienti. Non utilizzare una fotocamera inferiore a 8 megapixel. La fotocamera utilizzata in questo esperimento era un megapixel da 12,2 megapixel su un Google Pixel 2.</li>
	<li>Ritaglia l'immagine per includere le lastre, ma escludi i coperchi o qualsiasi altra cosa sullo sfondo dell'immagine. Carica l'immagine ritagliata in Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Modificare l'immagine in bianco e nero utilizzando i comandi seguenti: Immagine, Regola, Soglia colore, Metodo soglia: Predefinito, Colore soglia: B&W, Spazio soglia: Lab. Deselezionare la casella Sfondo scuro. L'immagine dovrebbe ora essere in bianco e nero. Il nero rappresenta lo sfondo chiaro e il bianco rappresenta le colonie metastatiche blu.</li>
	<li>Utilizzando lo strumento Cerchio sulla barra degli strumenti Fiji-ImageJ, selezionate l'area da analizzare. Disegnare un cerchio da utilizzare per tutte le piastre per assicurarsi che ogni piastra sia analizzata per l'area delle stesse dimensioni. Scegliete una dimensione che massimizzi l'area analizzata sulle piastre riducendo al minimo il rumore di fondo che appare sul bordo delle piastre. La dimensione viene visualizzata nella barra degli strumenti man mano che viene disegnata, quindi è possibile creare un cerchio perfetto monitorando l'altezza e la larghezza man mano che il cerchio viene disegnato.</li>
	<li>Analizzare il cerchio selezionato per determinare quale percentuale dell'area è bianca, che rappresenta l'area della piastra con colonie metastatiche blu. Utilizzare i comandi seguenti: Analizzare, analizzare particelle, dimensioni (pixel2):0-Infinito, Circolarità: 0,00-1,00, Mostra: nulla e selezionare la casella Riepiloga. Colpisci OK.</li>
	<li>Registrare il risultato % area. Questa è la percentuale dell'area selezionata che è bianca e rappresenta quindi il carico metastatico. NOTA: si consiglia di salvare i risultati in Fiji-ImageJ o copiare/incollare l'intera pagina dei risultati in un documento separato. Se i risultati di % Area sono imprevisti o sospetti, è quindi possibile vedere se anche una qualsiasi delle altre misurazioni era sospetta o se % Area è stata registrata in modo errato.</li>
	<li>Spostare il cerchio, senza alterarne le dimensioni afferrandolo al centro, nella piastra successiva dell'immagine. Ripetere i passaggi 7.6 e 7.7 per tutte le lastre dell'immagine.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.8 su almeno altre due immagini. Una volta analizzate tutte le lastre e le immagini, media i risultati dell'area % tra immagini diverse per ogni piastra per mitigare eventuali incongruenze tra le immagini.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
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<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come dimostrato, il conteggio manuale delle colonie metastatiche su ogni piastra polmonare può essere un metodo impreciso e impreciso per quantificare la metastasi polmonare, dimostrando la necessità di un migliore mezzo di quantificazione (Figura 2). L'analisi istopatologica differiva leggermente sia dal conteggio manuale che dall'analisi Fiji-ImageJ (Figura 2B e 4D), probabilmente perché le diapositive H&E non sono un campione rappresentativo ...

A una donna su otto verrà diagnosticato un cancro al seno nel corso della sua vita, eppure nonostante le molteplici opzioni di trattamento il cancro al seno è la seconda causa principale di decessi correlati al cancro nelle donneamericane 1. Queste donne non stanno morendo per il tumore primario nel seno. Invece, il carico metastatico è responsabile della mortalità di questa malattia in quanto comunemente si diffonde al polmone, all'osso, al cervello, al fegato e ai linfonodi2. Per questo motivo, i modelli di cancro al seno devono valutare la metastasi per contribuire a frenare la mortalità di questa malattia. Il modello di cancro al seno murino 4T1 è un protocollo superbo per raggiungere questo obiettivo. Il metodo qui descritto offre un miglioramento al modello 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ per quantificare la metastasi polmonare, producendo risultati coerenti e rapidi.
Il modello 4T1 è ben consolidato, con la maggior parte dei laboratori che utilizzano protocolli come quelli descritti da Pulaski e Ostrand-Rosenberg nel 20013. La linea cellulare 4T1 è resistente alla 6-tioguanina (6TG) e rappresentativa dello stadio IV, tumore al seno triplo negativo3,4,5. È clinicamente rilevante in quanto è un modello ortotopico e si metastasi spontaneamente agli stessi organi del cancro al senoumano 3,4. Le cellule 4T1 si metastasi spontaneamente ad una velocità prevedibile in base alla quantità di cellule iniettate3,4. È importante sottolineare che le differenze genetiche tra i topi qui utilizzati hanno causato una variabilità inter-individuale prevista nel carico metastatico. Per valutare la metastasi, i tessuti vengono raccolti per raccogliere e quantificare le cellule tumorali in siti distanti utilizzando la selezione 6TG e la colorazione blu di metilene. Il risultato è una raccolta di piastre di coltura tissutale con punti blu che rappresentano colonie metastatiche. Tuttavia, il protocollo di Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica le colonie metastatiche contandole manualmente, e quindi questo è stato il mezzo standard per valutare la metastasi in questo modello. Mentre questo è facile per i tessuti con basso carico metastatico, tessuti come i polmoni sono spesso carichi di metastasi. Poiché le placche polmonari possono essere altamente confluenti, quantificare con precisione e precisione le colonie metastatiche attraverso il conteggio manuale è difficile e incline all'errore umano. Per quantificare meglio il carico metastatico, descriviamo l'utilizzo di Fiji-ImageJ per una soluzione basata su computer all'errore di conteggio umano. L'analisi istopatologica con colorazione ematossilina ed eosina (H&E) è un altro mezzo per quantificare le metastasi polmonari, ed è interessante notare che è stato anche migliorato con il software Fiji-ImageJ6,7. Tuttavia, poiché l'analisi istopatologica osserva una singola fetta del polmone, può essere imprecisa e non rappresentativa. Questo perché il modello 4T1 causa diverse lesioni metastatiche in tutto l'organo che non sono distribuite uniformemente. Mentre le tendenze generali tra l'analisi istopatologica e il conteggio manualepossono essere simili 8, i singoli valori possono differire e quindi l'analisi istopatologica non dovrebbe essere utilizzata come unico mezzo di quantificazione. Dimostriamo il beneficio rispetto all'analisi istopatologica e le incongruenze nel conteggio manuale tra i diversi contatori, dimostrando allo stesso tempo la coerenza dell'utilizzo di Fiji-ImageJ. Inoltre, mostriamo che questo metodo può ridurre il tempo di incubazione da 10-14 giorni a 5 giorni, il che significa che i ricercatori possono analizzare i dati del loro studio molto prima rispetto a quando si affidano al conteggio manuale.
Questo metodo è un insieme di semplici regolazioni del protocollo3di Pulaski e Ostrand-Rosenberg . Poiché il modello 4T1 è ampiamente utilizzato e poiché la metastasi polmonare è un parametro critico da misurare nei modelli preclinici, crediamo che questo metodo possa essere ampiamente utilizzato ed è altamente prezioso per i ricercatori sul cancro al seno. Le uniche forniture aggiuntive necessarie sono una fotocamera e l'accesso a un computer con Fiji-ImageJ, un software libero utilizzato frequentemente nell'analisi delle immagini9. Questo metodo si concentra specificamente sulla metastasi polmonare, ma potrebbe essere utilizzato per altri tessuti con un significativo carico metastatico.

<table><tbody><tr><td>Camera per anestesia</td><td>Vedi commenti</td><td>Vedi commenti Usa materiali</td><td>approvati nelle politiche del tuo istituto</td></tr><tr><td>Agente anestetico</td><td>Vedi commenti</td><td>Vedi commenti Usa materiali</td><td>approvati nelle politiche del tuo istituto</td></tr><tr><td>BALB/c Topi femmina</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Forbici smussate</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Calcolatrice</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Qualsiasi Minimo 8 megapixel</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td>Deve essere in grado di 125 x g e 300 x g</td></tr><tr><td>Configurazione dell'eutanasia di CO2</td><td>Vedi commenti</td><td>Vedi commenti</td><td>Utilizzare materiali approvati nelle politiche della tua istituzione</td></tr><tr><td>Cella frigorifera, frigorifero, cella frigorifera</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td></td></tr><tr><td>Computer con Fiji-ImageJ</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td>Deve essere in grado di eseguire Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>Camera di conteggio</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Vedi commenti</td><td>Vedi commenti</td><td>Deve essere in grado di raggiungere il 5% di CO2 e 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Perni o aghi</td><td></td><td>Qualsiasi</td><td>Qualsiasi Per bloccare i topi durante l'autopsia</td></tr><tr><td>Calibri in plastica</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Bilanciere o rotella</td><td>rotante Qualsiasi</td><td>Qualsiasi</td><td></td></tr><tr><td>Forbici affilate</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterile monouso con membrana in PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Flaconi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flaconi</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T-75</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in plastica a tre angoli</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Utilizzato per pesare i topi</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 3,5 cm</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale da 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>piastra da 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>provetta per centrifuga da 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Soluzione salina tamponata con phostfato di Dulbco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific SH30028FS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>aghi da 27 g 1/2 pollici</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&timido; 2539&trade;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Tioguanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro cellulare M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Diluire al 70% con acqua deionizzata</td></tr></tbody></table>

utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4t1

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Il cancro al seno è una malignità devastante, che rappresenta 40.000 decessi femminili e il 30% delle nuove diagnosi di cancro femminile solo negli Stati Uniti nel 2019. La causa principale dei decessi correlati al cancro al seno è il peso metastatico. Pertanto, i modelli preclinici per il cancro al seno devono analizzare il carico metastatico per essere clinicamente rilevanti. Il modello di cancro al seno 4T1 fornisce un modello di topo spontaneamente metastasibile e quantificabile per il cancro al seno umano allo stadio IV. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli 4T1 quantifica il carico metastatico contando manualmente le colonie macchiate sulle piastre di coltura tissutale. Mentre questo è sufficiente per i tessuti con un minore carico metastatico, l'errore umano nel conteggio manuale causa risultati incoerenti e variabili quando le piastre sono confluenti e difficili da contare. Questo metodo offre una soluzione basata su computer all'errore di conteggio umano. Qui, valutiamo il protocollo usando il polmone, un tessuto altamente metastatico nel modello 4T1. Le immagini di lastre macchiate di metilene blu vengono acquisite e caricate per l'analisi in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina quindi la percentuale dell'area selezionata dell'immagine che è blu, rappresentando la percentuale della piastra con carico metastatico. Questo approccio basato su computer offre risultati più coerenti e rapidi rispetto al conteggio manuale o alla valutazione istopatologica per tessuti altamente metastatici. La coerenza dei risultati di Fiji-ImageJ dipende dalla qualità dell'immagine. Possono verificarsi lievi variazioni nei risultati tra le immagini, quindi si consiglia di prendere più immagini e mediare i risultati. Nonostante i suoi limiti minimi, questo metodo è un miglioramento nella quantificazione del carico metastatico nel polmone offrendo risultati coerenti e rapidi.

Questo metodo contiene semplici regolazioni dal protocollo3 Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T1 e può essere visualizzato nella figura 1. Quando 3 ricercatori separati hanno contato manualmente colonie metastatiche per 12 piastre polmonari (diluizione 1:10), i risultati sono stati molto incoerenti tra diversi contatori(Figura 2A). Tutti i ricercatori sono stati indirizzati a "contare le colonie metastatiche che appaiono come punti blu", ma le...

Descriviamo un metodo più coerente e rapido per quantificare la metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ.

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Questo protocollo quantifica la metastasi polmonare, che è una causa aggressiva e comune di morte correlata al cancro al seno, con maggiore precisione ed efficienza in un modello di cancro al seno preclinico. Rispetto alla tecnica originale, questo protocollo offre ai ricercatori risultati più rapidi e coerenti. Allevia l'errore di conteggio umano attraverso la tecnologia informatica facile da usare.Questa tecnica può assolutamente essere estesa alla ricerca preclinica studiando gli effetti delle terapie contro il cancro al seno sulla metastasi polmonare consentendo ai ricercatori di dimostrare una diminuzione del carico metastatico dopo un trattamento di successo. Iniziare etichettando un tubo conico da 15 millilitri per il campione di tessuto. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di tipo quattro miscela di collagenasi e 30 unità di elastasi al tubo.Spostare bene il polmone in un PO 'di HBSS 1X pulito e ruotarlo con le forcep per rimuovere il sangue rimanente, quindi trasferirlo su una piastra di coltura tissutale vuota di 3,5 centimetri. Tritare il polmone con le forbici, quindi sciacquare il piatto con 2,5 millilitri di HBSS e trasferire l'HBSS con i pezzi polmonari in un tubo conico preparato da 15 millilitri con il cocktail di collagenasi ed elastasi. Incubare il tubo per 75 minuti a quattro gradi Celsius su un rocker o una ruota rotante.Nel frattempo, etichettare un tubo di centrifuga da 50 millilitri e una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri per ogni topo. Se si fa una diluizione, etichettare abbastanza piastre di coltura tissutale per le diluizioni. Portare il volume del tubo fino a 10 millilitri con 1X HBSS, quindi versare il contenuto su un filtro a celle da 70 micrometri nel tubo conico da 50 millilitri.Utilizzare lo stantuffo di una siringa millilitro per macinare delicatamente il campione attraverso il colino. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 350 volte G e scartare il supernatante, quindi lavare il pellet due volte con 10 millilitri di 1X HBSS. Rimescolare il pellet in 10 millilitri di 60 micromolari 6-tioguanina mezzi di coltura completi e placcare i campioni nelle piastre di coltura cellulare di 10 centimetri utilizzando uno schema di diluizione, se lo si desidera.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Versare i mezzi di coltura dalle piastre nel contenitore di rifiuti appropriato. Per fissare le cellule, aggiungere cinque millilitri di metanolo non diluito a ogni piastra e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di ruotare il metanolo in modo che copra l'intera piastra.Versare il metanolo dalle piastre nel contenitore di scarto appropriato, quindi sciacquare ogni piastra con cinque millilitri di acqua distillata. Aggiungere cinque millilitri dello 0,03% di blu di metilene per piastra e incubarlo per cinque minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di ruotare la soluzione blu di metilene in modo che copra l'intera piastra. Versare il blu di metilene nell'apposito contenitore di rifiuti e risciacquare nuovamente ogni piastra con cinque millilitri di acqua distillata.Capovolgere la piastra e tamponarla contro un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra sul coperchio e lasciarla asciugare all'aria durante la notte. Le colonie metastatiche saranno blu.Una volta che i piatti si sono asciugati, possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato. Rimuovere i coperchi etichettati dalle piastre, facendo attenzione a garantire una chiara identificazione dei campioni. Allinea tutte le piastre polmonari macchiate su una superficie pulita e leggera.Scatta una foto della collezione di piatti in un'area ben illuminata, assicurandoti di ridurre al minimo i riflessi. I riflessi nelle piastre influenzeranno l'analisi delle immagini e dovrebbero essere evitati. Presta molta attenzione alle fotografie scattate e scatta diverse foto da diverse angolazioni.Dopo aver fotografato le lastre, ritagliare l'immagine per escludere i coperchi o qualsiasi altra cosa sullo sfondo. Apri l'immagine in Fiji ImageJ e cambiala in bianco e nero facendo clic su immagine, regola e soglia di colore. Selezionare quindi predefinito per il metodo di soglia, bianco e nero per il colore di soglia e lab per lo spazio colore.Assicurarsi che la casella di sfondo scura non sia selezionata. L'immagine dovrebbe ora essere in bianco e nero. Il nero rappresenta lo sfondo chiaro e il bianco rappresenta le colonie metastatiche blu.Utilizzate lo strumento cerchio per selezionare l'area da analizzare. Disegnare un cerchio da utilizzare per tutte le piastre per assicurarsi che ogni piastra sia analizzata per la stessa area di dimensioni. Scegli una dimensione che massimizzi l'area analizzata sulle piastre riducendo al minimo il rumore di fondo che appare sul bordo delle piastre.Le dimensioni vengono visualizzata nella barra degli strumenti man mano che viene disegnata. Analizzare il cerchio selezionato per determinare la percentuale di area bianca. Fare clic su analizza e analizzare le particelle, quindi selezionare da zero a infinito per le dimensioni, da zero a uno per la circolarità e niente per lo spettacolo.Selezionare la casella riepilogata e premere OK. Spostate il cerchio sulla piastra successiva dell'immagine afferrandola al centro e ripetete l'analisi. Copiare e incollare il risultato in un foglio di calcolo.L'area percentuale, che rappresenta la percentuale dell'area selezionata bianca, rappresenta il carico metastatico. Una volta analizzate tutte le lastre e le immagini, media i risultati dell'area percentuale tra immagini diverse per ogni piastra per mitigare eventuali incongruenze tra le immagini. L'analisi di Fiji ImageJ è stata confrontata con il conteggio manuale e l'analisi istopatologica.Quando tre ricercatori separati contavano manualmente le colonie metastatiche, i risultati erano incoerenti tra i contatori. I risultati di Fiji ImageJ erano coerenti tra i contatori per ciascuna delle tre immagini. I risultati delle tre immagini e dei tre contatori sono stati combinati per ogni piastra polmonare.I risultati sono stati mediati per ogni piastra per tenere conto delle variazioni tra le immagini, che hanno fornito risultati coerenti tra i contatori. Quando si classificano le lastre dalla maggior parte alla meno metastatica, il conteggio manuale concordava sulla piastra più confluente, ma tutti i seguenti ranghi erano incoerenti. I ranghi dei risultati medi di Fiji ImageJ erano molto più coerenti tra i contatori.Per dimostrare l'importanza di evitare riflessi nelle immagini, viene mostrata un'immagine con il riflesso di una mano e la sua successiva analisi Fiji ImageJ insieme a un'immagine della stessa lastra senza riflessione. Le imperfezioni scure da una superficie di fondo sporca o da un residuo di campione di sangue sulle piastre possono anche influire negativamente sull'analisi ImageJ delle Fiji. Questa piastra sanguigna ha solo due colonie metastatiche, ma il residuo scuro ha fatto sì che Fiji ImageJ la considera 31,6% metastatica.Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di esaminare attentamente le immagini per la riflessione, utilizzare lo stesso cerchio di dimensioni per ogni piastra nell'immagine e mediare i risultati per ogni lastra tra almeno tre immagini separate.

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Ricerca sul cancro

Questo protocollo descrive come utilizzare quantitativa Real-time PCR (QRT-PCR) per rilevare l'mRNA specifici di cellule tumorali rappresentano metastasi all'interno del tessuto polmonare del mouse.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Un modello di tumore primario del cancro al seno ortotopica e la rimozione chirurgica del tumore primario di estendere la vita del mouse per generare metastasi spontanee sono descritti. La crescita del tumore e la progressione sono monitorati e quantificati mediante imaging di fluorescenza luciferasi.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

In questo protocollo, descriviamo come utilizzare [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomografia a emissione di positroni e la tomografia computata (18F-FDG PET/CT) imaging per misurare la risposta metabolica del tumore per la terapia mirata MLN0128 in un  Kras/Lkb1 topo mutante modello di cancro ai polmoni e accoppiato con autoradiografia ex vivo ad alta risoluzione e l'istologia quantitativa di imaging.

Utilizzando 18F-FDG PET/CT Imaging e l'istologia quantitativa per misurare i cambiamenti dinamici nel metabolismo del glucosio in modelli murini di cancro ai polmoni

Questo lavoro preconfigura un protocollo avanzato per valutare con precisione il carico del tumore rilevando segnali di proteina fluorescente e bioluminescenza verdi, nonché l'integrazione della tecnica di rilevamento molecolare quantitativo.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri un metodo di analisi delle immagini con Fiji-ImageJ per quantificare le metastasi polmonari nel modello 4T1 di cancro al seno. Questa tecnica riduce gli errori umani e fornisce risultati più rapidi e coerenti per la ricerca preclinica.

Utilizzo dellanalisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 (Video) | JoVE Journal

Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

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