Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo
25 ottobre 2021
Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.
Gli epatociti primari di topo sono importanti negli studi sul fegato. Soprattutto per il metabolismo del glucosio e i test antidroga epatici. Per quanto riguarda il tempo, il processo di isolamento può richiedere molto tempo e l'energia costosa.
Questo protocollo può fornire un modo efficiente per isolare gli epatociti primari del topo. È tempo e lavoro amichevole. Richiede pochissimi passaggi con tutte le regioni disponibili in commercio.
Inizia usando la pompa peristaltica per iniziare a pompare acqua doppia distillata riscaldata ad una velocità di 4 ml al minuto, per cinque minuti. Quindi cambiare il tubo di pompaggio dall'acqua al mezzo di perfusione riscaldato. Monitoraggio della bolla d'aria tra l'acqua e il mezzo di perfusione.
Aiuterà a tracciare il flusso del mezzo di perfusione attraverso il sistema. Quindi disinfettare l'addome di un topo femmina C57 nero 6J anestetizzato di otto settimane con il 70% di etanolo. E usando una forbice, tagliare l'addome per esporre il fegato, la vena porta e la vena cava inferiore.
Quindi arrestare la pompa peristaltica. Dopo aver assicurato che il tubo di pompaggio contenga mezzo di perfusione e non acqua. Inserire un catetere calibro 24 nella vena cava inferiore.
Riaccendere la pompa e aprire la vena porta. Mentre il mezzo di perfusione viene pompato, premere la vena porta ogni minuto per consentire al liquido di raggiungere ogni angolo del fegato. Continuare a pompare per circa tre o cinque minuti o fino a quando il liquido svuotato è limpido.
Quindi cambiare il tubo di pompaggio dal mezzo di perfusione al mezzo di distribuzione della collagenasi. E premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato. Continuare a pompare fino a quando tutti i 25 ml del mezzo di distribuzione della collagenasi sono esauriti.
Quindi isolare l'intero fegato senza la cistifellea. E lo ha messo in 30 ml di mezzo di lavaggio in una capsula di Petri su ghiaccio. Usando la pinza strappare il fegato in pezzi per rilasciare epatociti primari nella soluzione.
In questa fase, il mezzo di lavaggio si trasforma in una soluzione torbida contenente epatociti primari rilasciati e piccoli pezzi di fegato. Filtrare questa soluzione torbida attraverso un filtro cellulare da 70 micron, in 20 ml di HBSS 1X per chiamata in un tubo da 50 ml su ghiaccio. E mescolare la soluzione invertendo il tubo 20 volte.
Quindi centrifugare la soluzione. Quindi, nel cappuccio della coltura del tessuto, aspirare il surnatante. E lavare il pellet con 30 ml di mezzo di lavaggio a freddo.
Pellet le celle ancora una volta con centrifugazione. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente il pellet in 25 ml di terreno di coltura. Contare le cellule e placcarle sulle piastre di coltura desiderate.
Secondo il disegno sperimentale. Dopo la placcatura, gli epatociti primari isolati sono stati saldamente attaccati di un'ora e completamente espansi dopo 12 ore. Negli epatociti isolati, i livelli di mRNA dei marcatori epatocitari, come transtiretina, CD95, ASGR1 e ASGR2, sono aumentati significativamente rispetto all'intero fegato.
Al contrario, la presenza di cellule immunitarie, cellule stellate e cellule endoteliali era inferiore. Come evidenziato da una forte diminuzione dei livelli di CD45, collagene di tipo 1 alfa 1 e mRNA della cellula endoteliale 2 chinasi 2. Suggerendo che questo protocollo può ridurre notevolmente l'interferenza da altre cellule epatiche.
Dopo la placcatura i livelli di ASGR1 e ASGR2 sono diminuiti con il tempo, ma rimangono paragonabili a tutto il fegato fino al punto temporale di 12 ore. Soprattutto per ASGR1. Il livello di espressione di CD81 legato alla membrana è stato costante fino a 48 ore.
In confronto, l'espressione del recettore toll-like 4 è generalmente aumentata ed è diventata superiore ai livelli in vivo dopo 48 ore. I saggi di sensibilità all'insulina hanno dimostrato che l'insulina ha promosso significativamente la fosforilazione di entrambi gli AKT alla serina 473. E la scatola forkhead 01 alla serina 256, negli epatociti.
Indicare la sensibilità degli epatociti primari all'insulina. I livelli di proteina fosfoenolpiruvato carbossichinasi sono aumentati significativamente dopo il trattamento con glucagone. Suggerendo che la via di produzione del glucosio è stata attivata.
Questa attivazione è stata ulteriormente confermata dall'aumento della produzione di glucosio. E con altri stimolatori della produzione di glucosio come Forskolin + IBMX. Questo protocollo può far risparmiare tempo ed energia per gli studi che utilizzano epatociti primari di topo.
Seguendo questo protocollo, possono essere condotti esperimenti correlati come l'ipotetico metabolismo del glucosio e i saggi dei biomarcatori farmaceutici.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo efficiente in termini di tempo e manodopera per l'isolamento di epatociti primari da mouse, fondamentali per la ricerca sulla funzione epatica e sul metabolismo. Il metodo utilizza reagenti disponibili in commercio per aumentare il rendimento e ridurre al minimo l'interferenza da parte delle cellule non parenchimali.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Metabolismo epatico
- Metabolismo del glucosio
- Test farmacologici
Sfondo
- Gli epatociti primari di topo sono essenziali per lo studio della biologia epatica.
- I metodi tradizionali di isolamento sono spesso lunghi e laboriosi.
- La riduzione del tempo di isolamento può facilitare esperimenti biologici più efficienti.
Metodi Utilizzati
- Protocollo di isolamento mediante pompa peristaltica e mezzo di collagenasi-dispasi.
- Modello murino: topi femmine C57BL/6J.
- Tecniche per la coltura cellulare e la misurazione dell'espressione genica.
Risultati principali
- Livelli aumentati di mRNA di marcatori degli epatociti rispetto al fegato intero.
- Presenza ridotta di cellule immunitarie e cellule endoteliali dopo l'isolamento.
- Dimostrata sensibilità all'insulina e attivazione delle vie di produzione del glucosio.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora significativamente l'efficienza dell'isolamento di epatociti primari.
- Maggiore comprensione del metabolismo del glucosio e della risposta ai farmaci negli studi epatici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'isolamento efficiente di epatociti primari è fondamentale per studi sul metabolismo epatico e sui test farmacologici, in cui i vincoli di tempo e di manodopera influiscono sulla produttività nei flussi di lavoro di scoperta. Questo protocollo riduce il tempo di isolamento a circa 35 minuti mantenendo resa e purezza degli epatociti, sostenendo test rapidi delle ipotesi in modelli preclinici. Il metodo consente la preparazione scalabile di sistemi pertinenti alle malattie per la riduzione meccanicistica dei rischi nelle fasi di validazione del target e di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Fornisce epatociti purificati per indagare ipotesi terapeutiche nei percorsi metabolici del glucosio e nella risposta epatica ai farmaci.
- Valore operativo: Riduce il tempo e lo sforzo richiesti, consentendo un throughput maggiore nei saggi di validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Produce epatociti con sensibilità all'insulina e attivazione della gluconeogenesi dimostrate, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli epatici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce epatociti con bassa interferenza da cellule non parenchimali, migliorando la specificità del saggio per lo screening di composti.
- Valore operativo: Utilizza reagenti disponibili in commercio e passaggi standardizzati, aumentando la riproducibilità tra diverse campagne di screening.
- Scalabilità: Consente la preparazione di sistemi biologici validati, adatti a piattaforme di screening ad alto contenuto o fenotipico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta sistemi rilevanti per le malattie per la validazione preclinica di composti mirati al fegato.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Genera epatociti con produzione di glucosio e risposta all'insulina validate, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione.
- Allineamento dei Biomarcatori: Mantiene l'espressione dei marcatori epatocitari (ASGR1, ASGR2, CD81) fino a 12 ore, consentendo la compatibilità con saggi basati su biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino agli studi preclinici, fornendo una fonte affidabile di epatociti primari per saggi del metabolismo epatico.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi sui percorsi epatici fornendo epatociti con espressione confermata di marcatori e risposte funzionali.
- Screening: Produce epatociti adatti alla valutazione di composti grazie alla ridotta contaminazione da cellule stromali e a una sensibilità all'insulina costante.
- Analisi: Supporta letture quantitative come la produzione di glucosio, saggi di fosforilazione e l'espressione di mRNA dei marcatori degli epatociti.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo epatociti che mantengono funzioni metaboliche chiave fino a 48 ore.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di isolamento riutilizzabile che standardizza la preparazione degli epatociti tra progetti e team.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sul metabolismo epatico grazie alla riduzione delle interferenze cellulari e alla validazione funzionale.
- Valore operativo: Ottimizza il flusso di lavoro con un numero minimo di passaggi e reagenti disponibili in commercio, migliorando l'efficienza del laboratorio.
- Valore strategico: Accelera i tempi di scoperta riducendo il tempo di isolamento da ore a circa 35 minuti, aumentando la frequenza dei saggi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei bersagli epatici fornendo modelli preclinici affidabili per la validazione dei meccanismi.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in tecniche chirurgiche e di perfusione nei topi.
- Presuppone l'accesso a una pompa peristaltica e a un ambiente sterile per colture cellulari.
- Necessita di una preparazione standardizzata dei reagenti (mezzo di perfusione, collagenasi-dispasi, mezzi di lavaggio e di coltura).
- Richiede considerazioni adattative per diverse ceppi o età di topi rispetto al modello femmina C57BL/6J utilizzato.
- È limitata dalla necessità di utilizzare immediatamente gli epatociti isolati per mantenerne l'integrità funzionale, poiché l'espressione dei marcatori diminuisce dopo 12 ore.
