Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi
November 12th, 2020
Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.
L'attuale visione dell'organizzazione laterale della membrana plasmatica rimane incompleta. Per questo motivo, è importante implementare alcune nuove tecniche innovative come la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a variazione spot. Si tratta di una tecnica molto potente caratterizzata da un'eccellente risoluzione temporale e spaziale.
Inoltre, non è invasivo e consente di studiare le membrane cellulari in condizioni fisiologiche. Ogni giorno prima di eseguire un esperimento, aprire tutti i diaframmi dell'iride e utilizzare un misuratore di potenza per misurare la potenza del laser con il primo iride completamente aperto. Ruotare la piastra a metà corsa per individuare la potenza massima.
Se la potenza del laser è inferiore al solito, utilizzare le iridi per controllare l'allineamento e spostare alternativamente L1 e M1 secondo necessità. Quindi annotare il valore di potenza in un quaderno di laboratorio. Per controllare il percorso di rilevamento, posizionare sull'obiettivo acqua, un vetrino coprioggetti e una gocciolina di due nanomolari di soluzione di rodamina 6G.
Quindi avvia il software del correlatore e registra i dati. La funzione di correlazione automatica dovrebbe mostrare una bassa quantità di rumore, una piccola dimensione dei rifiuti e un alto tasso di conteggio per molecola al secondo. Per calibrare la dimensione dello spot, posizionare un vetrino coprioggetti codificato per colture cellulari sull'obiettivo di immersione in acqua e aggiungere 200 microlitri di soluzione di rodamina 6G a due nanomolari al vetrino coprioggetti.
Regolare la potenza del raggio laser a 488 nanometri a 300 microwatt e nel software, selezionare la porta del microscopio di rilevamento dell'illuminazione svFCS. Accendere l'APD e aprire il diaframma fino a quando non cade un segnale per ottenere la dimensione minima del rifiuto o chiuderlo per una dimensione del rifiuto maggiore. Registra circa 10 funzioni di correlazione automatica di 20 secondi per migliorare la riproducibilità statistica e disattivare l'APD.
In un programma di analisi dei dati appropriato, controllare e scartare le esecuzioni con forti fluttuazioni dovute agli aggregati molecolari, quindi adattare la media della funzione di autocorrelazione mantenuta con un modello di diffusione 3D, estrarre il tempo medio di diffusione dai parametri di adattamento e salvare i dati come file TXT. Per l'analisi svFCS, regolare il fascio di 488 nanometri alimentato tra due e quattro microwatt ed equilibrare i campioni per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Selezionare la porta del microscopio di rilevamento dell'illuminazione svFCS e sull'APD.
Quindi, eseguire una scansione XY e una scansione Z della cella selezionata. Selezionare la membrana plasmatica nella parte superiore della cellula per individuare il punto confocale alla massima intensità di fluorescenza e avviare l'acquisizione dei dati. Nel software del correlatore, registrare una serie di 20 esecuzioni di cinque secondi.
Dopo l'ultima esecuzione, spegnere l'APD ed eliminare eventuali esecuzioni impreviste come dimostrato. Adatta la funzione di correlazione automatica media con un modello di diffusione 2D a due specie e salva i parametri di adattamento nel file TXT salvato in precedenza. Quando tutte le cellule di interesse sono state registrate, analizzare almeno quattro dimensioni dei rifiuti che variano tra 200 e 400 nanometri per stabilire un'unica legge di diffusione.
Quindi, in MATLAB, selezionare una cartella contenente tutti i file TXT corrispondenti ad almeno quattro esperimenti sulla dimensione dei rifiuti e tracciare il tempo di diffusione rispetto al rifiuto quadrato. In questa figura si può osservare una legge di diffusione per la Thy1-GFP espressa nelle cellule Cos7. La legge di diffusione ha un valore di tempo zero positivo, indicando che il Thy1-GFP è confinato all'interno di strutture di nano domini della membrana plasmatica.
In questa analisi, il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha portato allo spostamento del valore zero del tempo della legge di diffusione a 7,36 più o meno 1,34 millisecondi. Confermando che la natura del confinamento con Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata ai nanodomini della zattera lipidica. Una piccola ma significativa diminuzione del contenuto di colesterolo totale è stata osservata anche durante il trattamento con colesterolo ossidasi.
Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al lembo esterno della membrana plasmatica, questi dati suggeriscono che la diminuzione osservata del colesterolo è associata solo alla membrana plasmatica e provoca la destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica. La cosa più importante quando si tenta questa procedura è la corretta calibrazione del sistema svFCS e la preparazione delle celle per l'analisi. svFCS è uno strumento eccellente per studiare l'organizzazione della membrana cellulare.
Tuttavia, può essere utilizzato anche per analizzare la diffusione di molecole intracellulari. Questa tecnica può essere implementata con successo in biomedicina al fine di determinare l'influenza dei potenziali farmaci sulle cellule viventi come le cellule tumorali.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la costruzione di un microscopio per Spettroscopia di Correlazione di Fluorescenza a Variazione Spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare alla membrana plasmatica delle cellule viventi. La tecnica offre un'eccellente risoluzione temporale e spaziale pur essendo non invasiva.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Microscopia Fluorescente
Sfondo
- L'organizzazione laterale della membrana plasmatica non è completamente compresa.
- Sono necessarie tecniche innovative come svFCS per ottenere migliori approfondimenti.
- svFCS consente di studiare le membrane cellulari in condizioni fisiologiche.
- Una corretta calibrazione e preparazione delle cellule sono cruciali per risultati accurati.
Obiettivo dello Studio
- Sviluppare un protocollo per la microscopia svFCS.
- Misurare la diffusione molecolare alla membrana plasmatica.
- Analizzare l'influenza del colesterolo sull'organizzazione della membrana.
Metodi Utilizzati
- Calibrazione del sistema svFCS utilizzando soluzione di rodamina 6G.
- Acquisizione dati attraverso scansioni XY e Z di cellule selezionate.
- Analisi delle leggi di diffusione utilizzando MATLAB.
- Confronto dei parametri di diffusione prima e dopo il trattamento con ossidasi del colesterolo.
Risultati Principali
- La diffusione di Thy1-GFP è confinata all'interno di strutture di dominio nano.
- Il trattamento con ossidasi del colesterolo sposta il valore di tempo zero della legge di diffusione.
- È stata osservata una diminuzione del contenuto totale di colesterolo.
- Lo studio suggerisce che il colesterolo influenza la stabilità delle raft lipidiche.
Conclusioni
- svFCS è efficace per studiare l'organizzazione della membrana cellulare.
- La tecnica può anche analizzare la diffusione delle molecole intracellulari.
- I risultati hanno implicazioni per la comprensione degli effetti dei farmaci sulle cellule viventi.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) enables high-resolution analysis of molecular diffusion at the plasma membrane under physiological conditions, providing critical insights into membrane organization and lipid raft dynamics. This capability supports target validation by elucidating the biophysical context of membrane-associated proteins, informing mechanistic de-risking in early discovery. The method’s non-invasive nature and compatibility with living cells enhance its utility in preclinical screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of membrane proteins like Thy1-GFP within nanodomain structures.
- Operational Value: Reveals cholesterol-dependent confinement, enabling functional validation of lipid raft associations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets whose membrane localization is sensitive to lipid environment perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline diffusion laws under physiological conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible diffusion time measurements across varying beam waist sizes, supporting assay standardization.
- Screening Relevance: Detects compound-induced shifts in diffusion parameters, indicating alterations in membrane organization or target engagement.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plasma membrane raft nanodomain disruption, relevant to pathologies involving lipid dysregulation.
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical validation by demonstrating how environmental perturbations (e.g., cholesterol modulation) alter target behavior.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic readouts that inform go/no-go criteria based on target resilience to membrane perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
svFCS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a biophysical layer of characterization that complements biochemical and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring diffusion coefficients and identifying confined vs. mobile molecular populations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized calibration using rhodamine 6G and validation of detection path integrity.
- Analytics: Delivers quantitative diffusion laws via MATLAB analysis of auto correlation functions, allowing comparison of molecular behavior across conditions.
- Translational Research: Links membrane organization changes to functional outcomes, supporting biomarker alignment when diffusion shifts correlate with phenotypic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying membrane protein dynamics across multiple targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving nanoscale confinement and diffusion heterogeneity at the plasma membrane.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized laser power calibration, detection path checks, and replicate auto correlation function averaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target stability in native-like membrane environments, reducing late-stage attrition due to unforeseen biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their dependence on lipid raft integrity for proper localization and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, laser safety, and correlation spectroscopy data analysis.
- Needs a customized fluorescence microscope with APD, correlator software, and precise laser power control (2–4 µW for svFCS measurements).
- Demands cross-team standardization of calibration protocols (e.g., rhodamine 6G spot size validation) and data analysis pipelines (e.g., MATLAB fitting of 2D diffusion models).
- Involves adaptation considerations for different membrane proteins, cell types, and perturbation agents beyond cholesterol oxidase.
- Limited by the need for careful sample preparation to avoid molecular aggregates and ensure physiological relevance during 37°C equilibration.
