Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

L'attuale visione dell'organizzazione laterale della membrana plasmatica rimane incompleta. Per questo motivo, è importante implementare alcune nuove tecniche innovative come la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a variazione spot. Si tratta di una tecnica molto potente caratterizzata da un'eccellente risoluzione temporale e spaziale.

Inoltre, non è invasivo e consente di studiare le membrane cellulari in condizioni fisiologiche. Ogni giorno prima di eseguire un esperimento, aprire tutti i diaframmi dell'iride e utilizzare un misuratore di potenza per misurare la potenza del laser con il primo iride completamente aperto. Ruotare la piastra a metà corsa per individuare la potenza massima.

Se la potenza del laser è inferiore al solito, utilizzare le iridi per controllare l'allineamento e spostare alternativamente L1 e M1 secondo necessità. Quindi annotare il valore di potenza in un quaderno di laboratorio. Per controllare il percorso di rilevamento, posizionare sull'obiettivo acqua, un vetrino coprioggetti e una gocciolina di due nanomolari di soluzione di rodamina 6G.

Quindi avvia il software del correlatore e registra i dati. La funzione di correlazione automatica dovrebbe mostrare una bassa quantità di rumore, una piccola dimensione dei rifiuti e un alto tasso di conteggio per molecola al secondo. Per calibrare la dimensione dello spot, posizionare un vetrino coprioggetti codificato per colture cellulari sull'obiettivo di immersione in acqua e aggiungere 200 microlitri di soluzione di rodamina 6G a due nanomolari al vetrino coprioggetti.

Regolare la potenza del raggio laser a 488 nanometri a 300 microwatt e nel software, selezionare la porta del microscopio di rilevamento dell'illuminazione svFCS. Accendere l'APD e aprire il diaframma fino a quando non cade un segnale per ottenere la dimensione minima del rifiuto o chiuderlo per una dimensione del rifiuto maggiore. Registra circa 10 funzioni di correlazione automatica di 20 secondi per migliorare la riproducibilità statistica e disattivare l'APD.

In un programma di analisi dei dati appropriato, controllare e scartare le esecuzioni con forti fluttuazioni dovute agli aggregati molecolari, quindi adattare la media della funzione di autocorrelazione mantenuta con un modello di diffusione 3D, estrarre il tempo medio di diffusione dai parametri di adattamento e salvare i dati come file TXT. Per l'analisi svFCS, regolare il fascio di 488 nanometri alimentato tra due e quattro microwatt ed equilibrare i campioni per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Selezionare la porta del microscopio di rilevamento dell'illuminazione svFCS e sull'APD.

Quindi, eseguire una scansione XY e una scansione Z della cella selezionata. Selezionare la membrana plasmatica nella parte superiore della cellula per individuare il punto confocale alla massima intensità di fluorescenza e avviare l'acquisizione dei dati. Nel software del correlatore, registrare una serie di 20 esecuzioni di cinque secondi.

Dopo l'ultima esecuzione, spegnere l'APD ed eliminare eventuali esecuzioni impreviste come dimostrato. Adatta la funzione di correlazione automatica media con un modello di diffusione 2D a due specie e salva i parametri di adattamento nel file TXT salvato in precedenza. Quando tutte le cellule di interesse sono state registrate, analizzare almeno quattro dimensioni dei rifiuti che variano tra 200 e 400 nanometri per stabilire un'unica legge di diffusione.

Quindi, in MATLAB, selezionare una cartella contenente tutti i file TXT corrispondenti ad almeno quattro esperimenti sulla dimensione dei rifiuti e tracciare il tempo di diffusione rispetto al rifiuto quadrato. In questa figura si può osservare una legge di diffusione per la Thy1-GFP espressa nelle cellule Cos7. La legge di diffusione ha un valore di tempo zero positivo, indicando che il Thy1-GFP è confinato all'interno di strutture di nano domini della membrana plasmatica.

In questa analisi, il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha portato allo spostamento del valore zero del tempo della legge di diffusione a 7,36 più o meno 1,34 millisecondi. Confermando che la natura del confinamento con Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata ai nanodomini della zattera lipidica. Una piccola ma significativa diminuzione del contenuto di colesterolo totale è stata osservata anche durante il trattamento con colesterolo ossidasi.

Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al lembo esterno della membrana plasmatica, questi dati suggeriscono che la diminuzione osservata del colesterolo è associata solo alla membrana plasmatica e provoca la destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica. La cosa più importante quando si tenta questa procedura è la corretta calibrazione del sistema svFCS e la preparazione delle celle per l'analisi. svFCS è uno strumento eccellente per studiare l'organizzazione della membrana cellulare.

Tuttavia, può essere utilizzato anche per analizzare la diffusione di molecole intracellulari. Questa tecnica può essere implementata con successo in biomedicina al fine di determinare l'influenza dei potenziali farmaci sulle cellule viventi come le cellule tumorali.