Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

Questo metodo consente di generare tubulina pura e competente per l'assemblaggio con modifiche post-traduzionali definite in quantità sufficienti per eseguire interi set di esperimenti in vitro. Questo protocollo, basato su cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione della tubulina, è facile da eseguire in qualsiasi laboratorio di biologia cellulare. Permette di generare buone quantità di tubulina con pochissimo tempo a disposizione.

Per purificare la tubulina dalle colture in sospensione, nove giorni prima della preparazione della tubulina, ravvivare e amplificare il tipo di cellula desiderato per ottenere sei piastre confluenti da 15 centimetri. Otto giorni prima della preparazione della tubulina, aggiungere un litro di terreno preriscaldato a ogni bottiglia di centrifuga per piatto sotto un armadio per colture cellulari e posizionare gli spinner su un tavolo di agitazione all'interno dell'incubatore per colture cellulari. Lasciare i cappucci laterali leggermente aperti per consentire al fluido di equilibrarsi con l'atmosfera dell'incubatrice.

Il giorno successivo, utilizzare le cellule delle piastre confluenti per inoculare le bottiglie di spinner. Rimetti i flaconi della centrifuga nell'incubatrice per una settimana con le valvole laterali leggermente aperte. Per raccogliere le cellule, trasferire le colture dalle bottiglie di filatura in bottiglie da centrifuga da un litro e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere ogni pellet in 10 millilitri di PBS ghiacciato e riunire le cellule risospese in una provetta da 50 millilitri per la centrifugazione a quattro gradi Celsius. Per un pellet di cella da 10 millilitri, aggiungere 10 millilitri di tampone di lisi al pellet e capovolgere il tubo più volte per risospendere le cellule. Per purificare la tubulina da colture cellulari aderenti, ravvivare e amplificare il tipo di cellula desiderato per ottenere 10 piastre confluenti da 15 centimetri il giorno della preparazione della tubulina.

Per raccogliere le cellule aderenti, trattando tre piastre alla volta, inclinare le piastre di coltura per rimuovere il terreno mentre una seconda persona lava delicatamente le cellule con sette millilitri di PBS-EDTA. Dopo il lavaggio, la seconda persona deve trattare le cellule con cinque millilitri di PBS-EDTA per piatto prima di chiedere a una terza persona di utilizzare un sollevatore di cellule per spingere delicatamente le cellule su un bordo del piatto. Quando le cellule sono state staccate, riunire le cellule di tutte e tre le piastre in una provetta da 50 millilitri su ghiaccio e sciacquare ogni piastra con altri due millilitri di PBS-EDTA per raccogliere le cellule rimanenti.

Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, scartare il surnatante per determinare il volume del pellet cellulare. Aggiungere il tampone di lisi, risospendere le cellule e trasferirle in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri. Sonicare le cellule per circa 45 impulsi.

Per la lisi cerebrale del topo, aggiungere 500 microlitri di tampone autorizzato a un singolo cervello raccolto da un topo adulto e utilizzare un miscelatore di tessuti per lisare il tessuto. Dopo aver ottenuto il lisato a 1/100 del suo volume a un volume uguale di tampone Laemmli 2X e far bollire la soluzione per cinque minuti. Conservalo a meno 20 gradi Celsius fino alla quantificazione.

Raccogli un campione in questo modo ad ogni fase della preparazione della tubulina. Per chiarificare il lisato, centrifugare il campione e utilizzare un ago lungo per trasferire con cura il surnatante trasparente in una nuova provetta, facendo attenzione a evitare lo strato superiore di galleggiamento. Dopo la chiarificazione del lisato, è essenziale rimuovere il materiale galleggiante nel surnatante, altrimenti potrebbe influire negativamente sull'efficienza della purificazione della tubulina.

Per polimerizzare la tubulina dal lisato chiarificato, mescolare l'intero volume del surnatante uno con un volume di 1/200 di GTP molare 0,2 molare e mezzo volume di glicerolo caldo in un tubo di dimensioni adeguate. Pipettare delicatamente il composto, facendo attenzione ad evitare di introdurre bolle d'aria. Sigillare i tubi con parafilm e metterli a bagnomaria a 30 gradi Celsius per 20 minuti.

Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta. Per depolimerizzare i microtubuli presenti nel pellet due, risospendere il pellet in BRB 80 ghiacciato per cinque minuti sul ghiaccio. Pipettare il campione prima con una pipetta P1000, poi con una pipetta P200, ogni cinque minuti per 20 minuti su ghiaccio.

Una volta che il campione è omogeneo, centrifugarlo e trasferire il surnatante ottenuto in una nuova provetta. Per rimuovere le proteine associate ai microtubuli dalla tubulina, mescolare l'intero volume del surnatante tre con un volume uguale di tubo S molare preriscaldato, lo stesso volume di glicerolo preriscaldato e un volume di 1/100 di GTP 0,2 molari. Incubare la miscela per 20 minuti a 30 gradi Celsius prima di centrifugare.

Trasferire il surnatante quattro contenente proteine associate ai microtubuli in una nuova provetta, il pellet contiene microtubuli polimerizzati. Dopo aver eseguito una terza polimerizzazione e depolimerizzazione, la quantità di tubulina raccolta può essere quantificata mediante analisi della pagina SDS. Il successo del processo di purificazione può essere confermato su una pagina SDS colorata con Coomassie.

Una resa inferiore al previsto della tubulina purificata può essere dovuta a una polimerizzazione inefficiente della tubulina, come evidenziato da una minore quantità di tubulina nella seconda, quarta e sesta frazione di pellet e da una quantità maggiore nella seconda, quarta e sesta frazione di surnatante. Per quantificare la tubulina purificata, i campioni possono essere analizzati accanto a quantità note di albumina sierica bovina. La densitometria quantitativa delle bande proteiche permette poi di calcolare la quantità di tubulina purificata.

Lo stato di modifica della tubulina può essere confermato dall'analisi immuno blot dei campioni. Il nostro protocollo consente l'isolamento della tubulina con modifiche post-traduzionali controllate. Con questa tubulina, possiamo impostare esperimenti di ricostituzione in vitro che ci permettono di determinare l'impatto delle modifiche della tubulina sulle proprietà delle microtuberiche, nonché sulle loro interazioni con le proteine associate ai microtubuli.