Name: Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Scopri il flusso di lavoro MRM per la quantificazione proteica nel tessuto cerebrale umano. Questo metodo di spettrometria di massa mirata consente rilevamenti accurati e supporta la scoperta di biomarcatori in proteomica clinica.

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Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.
Estendiamo i nostri ringraziamenti speciali al signor Rishabh Yadav per la realizzazione e il montaggio dell'intero video e al signor Nishant Nerurkar per il suo lavoro nel montaggio dell'audio.

Questo studio coinvolge campioni di tessuto cerebrale di partecipanti umani, esaminati e approvati da TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato e scritto a partecipare a questo studio.
1 Estrazione di proteine dal tessuto cerebrale
<ol><li>Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) utilizzando una micropipetta. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere il sangue sulla superficie esterna del tessuto e deve essere ripetuto se necessario. Si consiglia di rimuovere il più possibile il sangue dai tessuti in quanto interferisce con la stima e l'elaborazione delle proteine a valle.</li>
	<li>Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 μL di tampone di lisi (Tampone A) al tubo contenente il tessuto. Il tampone A contiene 8 M di urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM di NaCl, 1 mM di MgCl2 e cocktail inibitore della proteasi (secondo le istruzioni del produttore). NOTA: La resa proteica varia a seconda di diversi fattori che vanno dalle condizioni in cui vengono conservati i campioni, alla quantità di materiale di partenza e all'efficienza della gestione dei campioni durante la lavorazione. Ridurre il volume del tampone A proporzionalmente quando si lavora con quantità di tessuto inferiori a 50 mg.</li>
	<li>Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Utilizzare i seguenti parametri per la sonicazione: ampiezza del 40%, ciclo di 5 secondi di on e off per 2:30 min.</li>
	<li>Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto. NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito a velocità media per 90 secondi seguito da incubazione su ghiaccio per 3-5 minuti.</li>
	<li>Centrifugare il contenuto del tubo a 6.000 x g per 15 min a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo. NOTA: Fare aliquote del campione e conservare a -80°C fino a nuovo utilizzo.</li>
</ol>2 Quantificazione delle proteine e controllo di qualità
<ol><li>Quantificare i campioni prima della digestione utilizzando un grafico standard realizzato con concentrazioni note di BSA. NOTA: Assicurarsi che il saggio utilizzato per la stima delle proteine sia compatibile con il tampone utilizzato per la produzione del lisirato proteico. Controllare la qualità del lasato proteico eseguendo un gel SDS-PAGE.</li>
</ol>3 Digestione delle proteine
<ol><li>Prendere 50 μg di proteine in un tubo di microcentrizzazione e ridurre le proteine aggiungendo Tris 2-carbossietilfosfina (TCEP) in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 mM. Incubare il contenuto a 37 °C per 1 ora.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide (IAA) al tubo in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 40 mM. Incubare il tubo al buio per 30 minuti. NOTA: Preparare IAA appena prima della sua aggiunta al tubo.</li>
	<li>Aggiungere il tampone B al tubo contenente le proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea nel tubo sia inferiore a 1 M. NOTA: Il tampone B è composto da 25 mM Tris (pH 8,0) e 1 mM CaCl2 e viene utilizzato per diluire i campioni. Alla diluizione, assicurarsi che il contenuto del tubo abbia un pH di 8 per una digestione ottimale delle proteine dopo l'aggiunta di tripsina.</li>
	<li>Aggiungere la tripsina in un rapporto enzima/proteina di 1:30 e incubare le provette durante la notte a 37 °C con agitazione costante.</li>
	<li>Dopo la digestione, concentrare il prodotto digerito in un concentratore sottovuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a -80 °C per un uso futuro.</li>
</ol>4 Dissalitura e quantificazione peptidica
NOTA: la desalazione o la pulizia dei peptidi è essenziale prima di caricare i campioni per LC-MS/MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire le colonne e causare danni allo strumento. Il processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 disponibili in commercio.
<ol><li>Attivare la punta dello stadio con 20 μL di acetonitrile al 50% (ACN) in acido formico allo 0,1% (FA). Centrifugare il contenuto a 1.000 x g per 1 minuto ed eliminare il flusso. NOTA: Le condizioni per la centrifugazione sono le stesse fino alla fine della procedura.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di 100% ACN in 0,1% FA e centrifugare il contenuto come al punto 4.1. NOTA: i passaggi di attivazione possono essere ripetuti un paio di volte.</li>
	<li>Dopo l'attivazione, passare 20 μL di campione peptidico ricostituito attraverso la punta dello stadio e la centrifuga come eseguito nel passaggio 4.1. NOTA: non scartare il flusso in questo passaggio.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.3 con il flusso attraverso almeno 5 volte per garantire il massimo legame peptidico alla punta dello stadio.</li>
	<li>Passare 20 μL dello 0,1% di FA attraverso la punta dello stadio ed eliminare il flusso. NOTA: ripetere questo passaggio altre due volte per risultati migliori.</li>
	<li>Eluire i peptidi legati in un tubo di microfuga fresco passando concentrazioni crescenti di ACN, cioè rispettivamente del 40%, 60% e 80%.</li>
	<li>Asciugare i peptidi in un concentratore di vuoto e procedere alla quantificazione del peptide.</li>
	<li>Ricostituire i peptidi essiccati in 0,1% FA e quantificare utilizzando il metodo Scopes5.</li>
</ol>5 Preparazione della lista di transizione degli obiettivi finalizzati
NOTA: una transizione si riferisce alla coppia di precursori (Q1) ai valori m/z del prodotto (Q3) in un esperimento MRM. Un peptide può avere una o molte transizioni, con lo stesso valore Q1 ma diversi valori Q3. Uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo richiede informazioni sulle transizioni per i peptidi e i loro prodotti da rilevare. Quindi, prima di iniziare un esperimento mirato, è necessario preparare un elenco di transizione. Questo può essere fatto utilizzando il repository online di SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) o un software open source chiamato Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
<ol><li>Scarica il recente file del proteoma umano FASTA da UniProt (https://www.uniprot.org/) e crea un file proteoma di sfondo inserendolo in Skyline. Nelle impostazioni peptidiche, vai al menu a discesa Proteoma in background e fai clic su Aggiungi. Feed nel file di sequenza FASTA del proteoma umano. Assicurarsi che questo database sia selezionato e che il valore di scissione mancato consentito sia impostato su 0 prima di procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Ora, sotto la scheda Filtro in Impostazioni peptidi delimitare la lunghezza dei peptidi accettati da 8 a 25 amminoacidi.</li>
	<li>In Impostazioni di transizione, nella scheda Filtro impostare Le cariche precursori su 2,3, impostare Cariche ioniche su 1 e impostare Tipi ioni su y. Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Selezionate N-terminale a prolina per ioni speciali e lasciate tutti gli altri parametri come predefiniti. NOTA: le impostazioni del peptide e della transizione possono variare in base all'esperimento.</li>
	<li>Inserire i peptidi o le proteine di interesse cliccando su Modifica e spostandosi su Inserisci. Per inserire proteine, copiare i loro id di adesione e inserire peptidi specifici, copiare le sequenze peptidiche. Il software mappa gli ID di adesione al proteoma di sfondo e l'elenco di transizione viene creato in base alle impostazioni peptidiche e di transizione.</li>
	<li>Esportare l'elenco di transizione. Assicurarsi che nel menu a discesa per Tipo di strumentosia selezionato lo strumento giusto. Per gli esperimenti di ottimizzazione, si può scegliere di dividere gli elenchi di transizione in numeri più piccoli impostando il numero desiderato di transizioni per file in Skyline. Ciò garantirà che lo strumento non sia sopraffatto per schermare troppe transizioni in una singola esecuzione. Il numero di transizioni deve essere ulteriormente ottimizzato per ottenere un unico metodo - questo lo menzioniamo d'ora in poi nella sezione di perfezionamento del metodo.</li>
</ol>6 parametri LC
<ol><li>Utilizzare un sistema a solvente binario con il solvente acquoso contenente lo 0,1% di FA (Solvente A) e il solvente organico contenente l'80% di ACN (Solvente B).</li>
	<li>Impostare la temperatura della colonna a 45 °C.</li>
	<li>Impostare un gradiente LC di 10 min con una portata di 450 μL/min (come mostrato nella Tabella S1).</li>
</ol>7 parametri MS
NOTA: Il test spiegato è stato sviluppato e ottimizzato per lo spettrometro di massa a triplo quadrupolo TSQ Altis.
<ol><li>Ottimizza i parametri di esecuzione come la risoluzione Q1 e Q3, il tempo di permanenza e il tempo di ciclo, un parametro alla volta. Troviamo che la risoluzione 0.7 per Q1 e Q3 funzioni meglio. Potrebbe essere necessario modificare il tempo di ciclo o il tempo di permanenza in base al numero di transizioni e alla larghezza media del picco dei peptidi monitorati.</li>
	<li>Utilizzare i parametri MS nella tabella S2 e nella tabella S3. La durata totale del metodo è di 10 min. NOTA: i parametri rimangono gli stessi per tutte le esecuzioni durante e dopo il perfezionamento del metodo, se non diversamente specificato. Per un nuovo esperimento, potrebbe essere necessario modificare determinati parametri a seconda del tipo di campione e delle fasi di elaborazione del campione.</li>
</ol>8 Sequenza di esecuzione e controllo di qualità dello strumento
<ol><li>Preparare una miscela di acqua: metanolo: isopropanolo: acetonitrile in rapporto 1:1:1:1. Usa questa miscela come uno spazio vuoto.</li>
	<li>Preparare peptidi per qualsiasi campione standard che può essere utilizzato per monitorare costantemente le prestazioni dello strumento. Questo sarà usato come standard QC. Rileviamo peptidi da digest BSA che sono stati ottimizzati e diamo una risposta buona e coerente per diversi giorni (Figura 2).</li>
	<li>Per eseguire i campioni, la sequenza dovrebbe iniziare con un paio di spazi vuoti, seguiti dallo standard QC e dai campioni clinici. Assicurarsi sempre che ci sia uno spazio vuoto tra due campioni consecutivi.</li>
	<li>Per facilitare il confronto, assicurarsi che quantità e volumi uguali di ciascun campione vengano iniettati ogni volta.</li>
</ol>9 Affinamento del metodo
<ol><li>Analizza i dati preliminari ottenuti dai campioni raggruppati utilizzando Skyline. Cerca il picco, le transizioni e i parametri giusti come la forma e l'intensità del picco per selezionare i risultati migliori. Salvare il file come nuovo progetto Skyline.</li>
	<li>Utilizzare una libreria per trovare il picco corrispondente migliore e di conseguenza si consiglia la migliore lista di transizione possibile. Una libreria è un insieme di picchi MS/MS disponibili dalla letteratura o da esperimenti interni.</li>
	<li>Esporta un nuovo elenco di transizione dal progetto Skyline appena salvato e utilizza questo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Acquisisci i dati dal nuovo metodo creato e ripeti il processo di perfezionamento delle transizioni utilizzando Skyline.</li>
	<li>Una volta che l'elenco dei peptidi e delle transizioni è finalizzato dopo l'analisi dei dati utilizzando Skyline, perfeziona il metodo provando diverse permutazioni del tempo di ciclo e del tempo di permanenza. NOTA: L'uso di peptidi sintetici marcati pesantemente e peptidi iRT (Indexed Retention Time) rende facile il perfezionamento del metodo8,9. È quindi consigliabile che la messa a punto del metodo venga eseguita utilizzando questi peptidi.</li>
	<li>Utilizzando le informazioni sul tempo di conservazione degli esperimenti di perfezionamento, creare un metodo finale pianificato (con una finestra di acquisizione definita).</li>
	<li>Preparare campioni per singoli soggetti. I dati saranno acquisiti per questi campioni utilizzando il metodo finale programmato.</li>
	<li>Una volta acquisiti i dati, è possibile eseguire ulteriori analisi a valle e confronti di gruppo importando i file raw in Skyline.</li>
</ol>

<ol><li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring-based+proteomics%3A+Workflows%2C+potential%2C+pitfalls+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li>
<li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine%3A+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li>
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<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li>
<li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SRMAtlas%3A+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li>
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<li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li>
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<li>Hüttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94(2012).</li>
<li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRM%2FMRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li>
<li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A%CE%B2+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li>
<li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li>
<li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li>
</ol>

Gli autori hanno ricevuto il sostegno di Thermofisher per la tassa di pubblicazione.

Tecniche come l'immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l'uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine identifi...

Durante l'ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l'immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile nella loro ricerca per comprendere meglio il ruolo delle proteine nelle cellule. Tuttavia, gli approcci di proteomica shotgun (Data dependent Acquisition o DDA) spesso non riescono a rilevare proteine a bassa abbondanza nei tessuti complessi oltre ad essere fortemente dipendenti dalla sensibilità e dalla risoluzione dello strumento. Negli ultimi due anni, i laboratori di tutto il mondo hanno sviluppato tecniche come Data Independent Acquisition (DIA) che richiedono una maggiore potenza di calcolo e un software affidabile in grado di gestire questi set di dati altamente complessi. Tuttavia, queste tecniche sono ancora un work in progress e non molto user friendly. Gli approcci proteomici mirati basati sulla SM forniscono un perfetto equilibrio tra la natura ad alto rendimento degli approcci SM e la sensibilità degli approcci di biologia molecolare come ELISA. Un esperimento mirato di proteomica basato sulla spettrometria di massa si concentra sulla rilevazione di proteine o peptidi guidati da ipotesi da esperimenti di proteomica basati sulla scoperta o attraverso la letteratura disponibile1,2. Il monitoraggio a reazione multipla (MRM) è uno di questi approcci mirati alla SM che utilizza uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem per il rilevamento e la quantificazione accurati di proteine / peptidi da campioni complessi. La tecnica offre maggiore sensibilità e specificità nonostante richieda l'uso di uno strumento a bassa risoluzione.
Un quadrupolo è costituito da 4 aste parallele, con ogni asta collegata all'asta diagonalmente opposta. Un campo fluttuante viene creato tra le aste quadrupolo applicando tensioni RF e DC alternate. La traiettoria degli ioni all'interno del quadrupolo è influenzata dalla presenza delle stesse tensioni attraverso barre opposte. Applicando la tensione RF a CC, la traiettoria degli ioni può essere stabilizzata. È questa proprietà del quadrupolo che gli consente di essere utilizzato come filtro di massa in grado di far passare selettivamente ioni specifici. A seconda delle esigenze, un quadrupolo può essere azionato sia in modalità statica che in modalità di scansione. La modalità statica consente il passaggio solo di ioni con un m/z specificato, rendendo la modalità altamente selettiva e specifica per lo ione di interesse. La modalità di scansione, d'altra parte, consente il passaggio di ioni su tutta la gamma m / z. Pertanto, gli spettrometri di massa a quadrupolo tandem possono funzionare in 4 modi possibili: i) il primo quadrupolo che opera in modalità statica mentre il secondo opera in modalità di scansione; ii) il primo quadrupolo operante in modalità di scansione mentre il secondo operante in modalità statica; iii) entrambe le quadruffle che operano in modalità di scansione; e iv) entrambi i quadrupoli operanti in modalità statica3. In un tipico esperimento MRM, entrambi i quadruttori operano in modalità statica consentendo di monitorare specifici precursori e i loro prodotti risultanti dopo la frammentazione. Questo rende la tecnica molto sensibile e selettiva permettendo una quantificazione accurata.
Per i biologi molecolari, il tessuto cerebrale umano e le sue cellule sono un tesoro. Queste notevoli unità di un organo sempre interessante del corpo umano possono fornire informazioni molecolari e cellulari sul suo funzionamento. Le indagini proteomiche del tessuto cerebrale possono non solo aiutarci a capire il funzionamento sistemico di un cervello sano, ma anche i percorsi cellulari che si disregolano quando inflitti da qualche malattia4. Tuttavia, il tessuto cerebrale con tutta la sua eterogeneità è un organo molto complesso da analizzare e richiede un approccio concertato per una migliore comprensione dei cambiamenti a livello molecolare. Il lavoro che segue descrive l'intero flusso di lavoro a partire dall'estrazione di proteine dal tessuto cerebrale, creando e ottimizzando i metodi per il test MRM, fino alla convalida dei bersagli (Figura 1). Qui, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti in un esperimento basato sulla MRM di successo che utilizza tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre la tecnica e le sue sfide a una comunità di ricerca più ampia.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado MS</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato Soluzione salina</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Merck</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (grado MS)</td><td>Pierce</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Merck</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Forniture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna Hypersil Gold C18</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Stage</td><td>Punte MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>Perle di zirconia/silice Prodotti</td><td>BioSpec</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Battitore di microsfere (omogeneizzatore)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre (spettrofotometro)</td><td>Thermo</td><td>MultiSkan Go Misuratore</td><td></td></tr> di <tr><td>pH</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Sonics</td><td>Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a secco con agitazione</td><td>Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa TSQ Altis</td><td>Thermo</td><td>TSQ02-10002</td><td></td></tr><tr><td>uHPLC - Vanquish</td><td>Thermo</td><td>VQF01-20001</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr></tbody></table>

flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

L'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell'ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l'immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l'uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell'esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.

Abbiamo eseguito la quantificazione relativa di 3 proteine da 10 campioni, 5 campioni da ciascun gruppo di pazienti con anomalie nel cervello. Queste proteine includevano Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) che sono noti per svolgere ruoli diversi nelle cellule cerebrali. L'analisi post-run dei dati è stata eseguita utilizzando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Sono stati monitorati un totale di 10 peptidi corrispondenti a 3 proteine. Questi includevano 3 peptidi per...

Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Gli approcci proteomici mirati stanno rapidamente diventando il metodo di scelta per la convalida delle proteine da esperimenti basati sulla proteomica a breve termine o da esperimenti basati sulla biologia molecolare. Il monitoraggio delle reazioni multiple è uno di questi approcci mirati che viene sempre più utilizzato per rilevare e quantificare le proteine da campioni biologici. In questo studio abbiamo attraversato i vari passaggi coinvolti nel rilevamento e nella quantificazione delle proteine dal tessuto cerebrale umano con l'intenzione di introdurre i lettori ai requisiti di base di un esperimento MRM.Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 microlitri di 1x soluzione salina tamponata con fosfato. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere qualsiasi sangue sulla superficie esterna del tessuto, e quindi è consigliabile rimuovere più sangue possibile. Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi al tubo contenente il tessuto.Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto. Centrifugare il contenuto del tubo a 6000 g per 15 minuti a quattro gradi centigradi.Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo. Prendi una piccola aliquota del surnatante e quantifica il contenuto proteico usando un test proteico standard. Qui mostriamo un esempio di stima delle proteine utilizzando Bradford Assay.Prendi 50 microgrammi di proteine in un tubo di microcentrifuga e riduci il contenuto aggiungendo TCEP in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 millimolari. Incubare il contenuto a 37 gradi per un'ora. Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide al tubo, in modo tale che la concentrazione finale sia di 40 millimolari.Incubare il tubo al buio per 30 minuti. Ora aggiungi il tampone B al tubo contenuto nelle proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea sia inferiore a un molare. Aggiungere la tripsina in 1 come a 30 rapporto enzima-proteina e incubare i tubi durante la notte a 37 gradi con agitazione costante.Dopo la digestione, concentrare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a meno 80 per un uso futuro. La desalazione, o pulizia dei peptidi, è essenziale prima di caricare i campioni su qualsiasi LC-MS MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire la colonna e influenzare la sensibilità dello strumento a lungo termine.Questo processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 STAGE disponibili in commercio. Qui abbiamo descritto il flusso di lavoro per la desassazione dei peptidi utilizzando una punta C18 STAGE. Dopo la dissamatrice, asciugare i peptidi in un concentratore a vuoto.Ricostituire questi peptidi puliti e procedere alla quantificazione utilizzando il metodo Scopes. Per questo, caricare due microlitri del campione in una piastra microgocce e calcolare la concentrazione come mostrato nella diapositiva. La preparazione della lista di transizione è un passo cruciale in un esperimento SRM o MRM.Un elenco di transizione contiene tutte le informazioni richieste dallo spettrometro di massa per monitorare la transizione. Ciò include i valori m per z degli ioni precursore e prodotto, l'energia di collisione della transizione, la polarità dello strumento e l'intervallo di tempo per l'acquisizione dei dati. Preparare l'elenco di transizione utilizzando Skyline.Preparare un proteoma di sfondo utilizzando il file Human Proteome Fasta di UniProt e assicurarsi che sia selezionato nella scheda Sfondo di Impostazioni peptidi. Nella scheda Filtro, impostare una lunghezza minima di 8 e una lunghezza massima di 25. Continuare a utilizzare le impostazioni predefinite se non ci sono altre modifiche nei peptidi.Una volta effettuate le impostazioni peptidiche, fare clic su Impostazioni di transizione. Nella scheda Filtro, impostare i costi precursori su 2 e 3. Impostare le cariche ioniche come 1 e impostare i tipi di ioni su y.Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Lasciare tutti i parametri come predefiniti. Ora inserisci gli id di adesione delle proteine target selezionate.Questo può essere fatto facendo clic sulla scheda Modifica, quindi selezionando Inserisci e infine incollando gli ID di adesione. Gli ID saranno mappati alle proteine nel proteoma di sfondo e una lista di transizione creata in base alle impostazioni peptidiche e di transizione impostate in precedenza. Esportare questo elenco di transizione.Assicurarsi che sia selezionato lo strumento giusto facendo clic sull'opzione a discesa Tipo di strumento. In questo caso, lo strumento è Thermo Altis. Poiché l'elenco di transizioni non definito ha troppe transizioni, mantenere un limite di sole 350 transizioni per elenco ed esportare come metodi multipli.Viene utilizzato un sistema a solvente binario. Il solvente A è 1% FA e il solvente B è 80% ACN. Mantenere la portata a 450 microlitro al minuto e il gradiente come mostrato.Impostare la temperatura del compartimento della colonna a 45 gradi Celsius. Per ulteriori dettagli sulla colonna e sul sistema LC, fare riferimento al testo. Assicurarsi che le impostazioni MS nel TSQ Altis siano come mostrato qui.Importare un singolo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Suggeriamo di mantenere la risoluzione per il quadrupolo 1 e il quadrupolo 3 a 7. Questi possono essere ulteriormente ottimizzati se necessario.Per garantire la coerenza delle esecuzioni e di conseguenza la qualità dei dati, preparare la sequenza di esecuzione come illustrato. Inizia con un paio di spazi vuoti, fai riferimento al testo per la composizione della miscela vuota, seguito da un BSA leggero standard QC di concentrazione nota per monitorare qualsiasi variazione nella risposta diurna dello strumento. Il QC fatto dovrebbe essere appena prima dei campioni.Quindi allineare tutti i campioni con spazi vuoti in mezzo. Iniettare volumi uguali di ciascun campione, rappresentando da 25 a 1 nanogrammo di peptidi per iniezione. Per creare un metodo raffinato, eseguire prima i metodi non predefiniti su campioni interi.Importa i risultati in Skyline e controlla manualmente ogni peptide. Per ogni peptide, selezionare un precursore che mostri costantemente buoni picchi in tutti i campioni. Eliminare precursori e peptidi che non mostrano buoni picchi.Assicurati che tutti i picchi siano annotati correttamente. Per selezionare il picco giusto e perfezionare ulteriormente le transizioni sotto ciascun precursore, è possibile utilizzare una libreria. Una libreria è un insieme di dati spettrali MS-MS abbinati a peptidi e transizioni degli attuali dati sperimentali.Selezionare picchi con valori DART P più vicini a 1 e rimuovere le transizioni che non corrispondono alla libreria. Un valore DART P indica la qualità della corrispondenza tra il picco sperimentale e il picco della libreria. Dopo uno o due round di ottimizzazione, un elenco raffinato sarà pronto.Questo elenco raffinato può essere eseguito per singoli campioni. Importa le corse raffinate in Skyline e annota correttamente i picchi. Utilizzare la scheda Annotazione in Impostazioni documento per annotare attentamente ogni esempio nella griglia del documento.Utilizzare la funzionalità Confronto di gruppo per creare confronti tra la condizione 1 e la condizione 2 dell'esperimento. Questo darà una tabella con i valori P regolati e i valori di modifica della piega tra i due gruppi. Per quanto ne scompariamo, questo è il primo studio che impiega l'uso di MRM per rilevare peptidi per le proteine Apolipoproteina A-1, Vimentina e Nicotinamide fosforibosiltransferasi in campioni di tessuto cerebrale umano.L'ottimizzazione di vari parametri come il gradiente LC, il tempo di permanenza, il tempo di ciclo e l'energia di collisione può influenzare notevolmente il successo di un esperimento MRM. Riteniamo che questa tecnica possa essere utilizzata per sviluppare modelli di biomarcatori con capacità di distinguere tra diverse condizioni cliniche e malattie.

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Fonte: Wulf, M., et.al. Protocollo basato su microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).Questo video mostra l'analisi di campioni di peptidi da granuli di neuromelanina (NMG) isolati da tessuto cerebrale umano post-mortem. I peptidi vengono prima separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e quindi analizzati mediante spettrometria di massa per determinare i loro rapporti massa/carica (m/z). I...

Analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina isolati da tessuto cerebrale umano

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Questo protocollo descrive come eseguire saggi di quantificazione assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi utilizzando il monitoraggio di reazioni selezionate. È stato utilizzato per quantificare con precisione le proteine della via di segnalazione della chemiotassi dei macrofagi di topo. La selezione dei peptidi target, lo sviluppo del saggio e i saggi qualitativi e quantitativi sono descritti in dettaglio.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Descriviamo un alto rendimento, multiplex, e il dosaggio mirato liquido cerebrospinale proteomica (CSF) sviluppata con un potenziale per la traduzione clinica. Il test può quantificare potenziali marcatori e fattori di rischio per la neurodegenerazione, come le varianti apolipoproteina E (E2, E3 e E4), e misurarne l'espressione allelica.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l'identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Qui, stabiliamo un metodo proteomico basato sulla spettrometria di massa utilizzando regioni isolate di interesse in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Questo protocollo viene utilizzato per analizzare il proteoma proveniente da specifiche aree tissutali in sezioni di tessuto archiviate fissate in formalina e incluse in paraffina.

Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Questo protocollo ha preparato con successo tessuto neovascolare di alta qualità sufficiente da campioni di glioma utilizzando microdissezione a cattura laser per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale, superando i limiti degli studi che tradizionalmente si concentrano principalmente sui fattori angiogeni e fornendo un profilo proteomico su larga scala dell'angiogenesi del glioma.

Preparazione di tessuti neovascolari da tessuti gliomatici umani per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale

Scopri il flusso di lavoro MRM per la quantificazione proteica nel tessuto cerebrale umano. Questo metodo di spettrometria di massa mirata consente rilevamenti accurati e supporta la scoperta di biomarcatori in proteomica clinica.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano (Video) | JoVE Journal

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

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