Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

Questa tecnica consente ai ricercatori di nutrire ed eseguire da soli misurazioni ad alta produttività per confrontare i volumi dei pasti consumati da centinaia di singole zanzare. Può essere adattativo per modificare il contenuto del pasto o per confrontare il volume consumato da diversi gruppi sperimentali. Questo protocollo ha lo scopo di essere facile da usare e a basso costo.

Per manipolazioni farmacologiche e genetiche, per studiare l'alimentazione con sangue di zanzara e il comportamento alimentare post-alluvione. L'organizzazione è fondamentale per questo protocollo. Prepara in anticipo la configurazione e i reagenti, in modo da poter consegnare rapidamente i pasti alle zanzare.

Per iniziare, trasferire da 1,98 a due millilitri di sangue di pecora defibrinato in una provetta conica da 15 millilitri. Se si esegue la quantificazione basata sulla fluorescenza delle dimensioni del pasto, aggiungere la soluzione di fluoresceina a una concentrazione finale dello 0,002%, riducendo il volume del sangue della stessa quantità della fluoresceina aggiunta. Conservare un millilitro della formulazione finale del pasto per generare la curva standard di riferimento.

Tutti i pasti e le soluzioni contenenti fluoresceina devono essere avvolti in un foglio di alluminio o tenuti al buio. Per preparare pasti salini privi di proteine, combina 600 microlitri di bicarbonato di sodio da 400 millimolari con 1,39 millilitri di acqua distillata doppia in un tubo conico da 15 millilitri. Se successivamente si desidera effettuare la quantificazione basata sulla fluorescenza delle dimensioni del pasto, aggiungere la soluzione di fluoresceina a una concentrazione finale dello 0,002% Riducendo il volume dell'acqua della stessa quantità della fluoresceina aggiunta.

Conservare almeno un millilitro della formulazione finale del pasto contenente lo 0,002% di fluoresceina per generare la curva standard di riferimento. Metti da parte i pasti preparati fino a quando non sei pronto per consegnarli. Tutti i pasti e le soluzioni contenenti fluoresceina devono essere avvolti in un foglio di alluminio o tenuti al buio.

Metti il gruppo sperimentale di zanzare femmine in un contenitore e coprile con una rete. Lasciate che queste femmine si acclimatino nella camera di alimentazione. Mettere da parte un gruppo di controllo di zanzare non nutrite a cui non verrà offerto un pasto.

Per costruire una provetta GLI, riempire una provetta conica da 50 millilitri con 40 millilitri di glicerolo al 100%. Sigillare il tubo conico aperto con due pezzi di parafilm per ridurre al minimo la possibilità di perdite. Facoltativamente, tenere il parafilm in posizione utilizzando degli elastici.

Capovolgere il tubo per assicurarsi che non vi siano fori o spazi vuoti. Per creare il dispositivo di erogazione dei pasti, praticare un foro centrato di 2,5 centimetri nel tappo a vite del tubo conico utilizzando una lama di rasoio affilata o una lava. Allungare un pezzo di parafilm in modo uniforme in modo che raddoppi all'incirca di dimensioni.

Il parafilm dovrebbe essere abbastanza sottile da consentire alle zanzare di perforarlo facilmente, ma non dovrebbero esserci perdite. Sigillare la superficie esterna del tappo a vite con il parafilm per coprire completamente il foro e mettere da parte il tappo. Riscaldare sia il tubo sigillato di glicerolo che i pasti di sangue e soluzione salina e un bagno d'acqua da 42 a 45 gradi Celsius per almeno 15 minuti.

Aggiungere l'ATP al pasto riscaldato e agitare accuratamente. Pipettare due millilitri di pasto riscaldato nella camera interna del tappo a vite e posizionare delicatamente su di esso il tubo conico riempito di glicerolo riscaldato invertito. Avvitare parzialmente il tappo con il pasto sul tubo riempito di glicerolo, quanto basta per evitare perdite del pasto o del glicerolo.

Posizionare il tubo gly assemblato sopra il contenitore delle zanzare, applicare l'anidride carbonica e lasciare che le zanzare possano accedere al mangime per almeno 15 minuti per raggiungere i tassi di alimentazione massimi. Dopo l'alimentazione, il tappo del tubo GLI può essere gettato come rifiuto a rischio biologico o riutilizzato dopo essere stato immerso in una soluzione di candeggina a bassa percentuale e risciacquato accuratamente in acqua. Per generare una curva standard di riferimento, preparare una diluizione seriale dello stesso pasto contenente lo 0,002% di fluoresceina che è stato offerto al gruppo sperimentale di zanzare.

Per ottenere la prima soluzione della curva standard, aggiungere 50 microlitri di farina contenente lo 0,002% di fluoresceina a 950 microlitri di PBS e agitare accuratamente. Eseguire due diluizioni per il resto delle soluzioni della curva standard, vorticando bene prima di ogni diluizione. Pipettare 100 microlitri di ciascuna delle soluzioni della curva standard in ciascuno degli otto pozzetti nella prima colonna di una piastra PCR a 96 pozzetti.

Aggiungere una zanzara di controllo anestetizzata o congelata non alimentata a ciascuno degli stessi otto pozzetti. Ripetere nella seconda colonna della piastra per una misurazione replicata. Aggiungere 100 microlitri di PBS a ciascun pozzetto rimanente per i gruppi di controllo e sperimentali non alimentati.

Come controllo negativo, aggiungere una zanzara non nutrita a ciascun pozzetto nelle due colonne successive della piastra. Aggiungere una zanzara per pozzetto ai pozzetti rimanenti dei gruppi sperimentali a cui è stato offerto un pasto. Aggiungere perle di vetro solido borosilicato da tre millimetri a ciascun pozzetto se si rompe il tessuto con l'omogeneizzatore per macina perline.

Sigillare accuratamente la piastra e rompere il tessuto, quindi centrifugare la piastra a 2000 giri/min per uno o due minuti per raccogliere il lisato. Preparare una piastra nera a 96 pozzetti con 180 microlitri di PBS in ogni pozzetto. Quindi, aggiungere 20 microlitri di lisato a ciascun pozzetto e mescolare.

Misurare l'intensità della fluoresceina utilizzando un lettore di piastre con i canali di eccitazione 485 e 520 canali di emissione. Generare la curva standard di riferimento tracciando il volume noto di farina rispetto alla corrispondente misurazione dell'intensità di fluorescenza. Utilizzando la curva standard di riferimento generata, estrapolare il volume del pasto ingerito da ciascuna delle zanzare del gruppo sperimentale.

Sottrarre la lettura media dell'intensità della fluorescenza del gruppo di controllo negativo non alimentato dalla lettura dell'intensità della fluorescenza di ciascun individuo del gruppo sperimentale per correggere l'autofluorescenza tissutale al basale. Per misurare le dimensioni del pasto di fluoresceina da un esperimento di alimentazione con sangue, è stata generata una curva standard tracciando le letture della fluorescenza dai pozzetti di riferimento designati contenenti una zanzara non alimentata e un volume noto del pasto con lo 0,002% di fluoresceina. Le letture della fluorescenza dei pozzetti rimanenti che contengono zanzare del gruppo di controllo negativo non alimentato delle zanzare o del gruppo sperimentale di zanzare a cui è stato offerto un pasto, vengono confrontate con questa curva standard per quantificare il volume del pasto consumato.

Sebbene a tutte le femmine del gruppo sperimentale sia stato offerto il pasto di sangue, alcune zanzare si sono nutrite e altre no. Questo protocollo può essere utilizzato per erogare e quantificare pasti con varie composizioni proteiche. I dati raccolti utilizzando i pasti con aggiunta di fluoro sono mostrati qui.

È stato anche eseguito un esperimento indipendente in cui le zanzare sono state classificate come alimentate o non nutrite dall'occhio, dopo che sono stati offerti loro pasti senza fluoro. Questo protocollo è stato utilizzato per determinare il volume consumato dei pasti con farmaci che regolano il comportamento di ricerca delle zanzare ospiti. In questi esperimenti, alle femmine è stato offerto un pasto salino con ATP con un agonista umano del secondo recettore NPY.

Questa tecnica è stata utilizzata anche per misurare il comportamento di alimentazione del nettare, sostituendo il tubo di gly con un batuffolo di cotone saturo con il 10% di saccarosio contenente lo 0,002% di fluoresceina, dimostrando che può essere utilizzato per misurare dimensioni di pasti più piccole o più variabili che non possono essere individuate con precisione dalle misurazioni del peso di gruppo. La cosa più importante quando si esegue questo protocollo, è organizzare i campioni in eventi e mettere da parte le zanzare non nutrite e un ML di ogni pasto per generare la curva standard. Seguendo questa procedura, è possibile osservare il comportamento degli animali dopo l'alimentazione del sangue e monitorare la digestione.

Questo metodo consente ai ricercatori di valutare i cambiamenti nel consumo di pasti nelle zanzare geneticamente modificate. Fornisce inoltre un modo semplice, rapido e non invasivo per somministrare farmaci alle zanzare e per testarne gli effetti sul comportamento.