Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Questo protocollo per purificare l'enzima triptofano sintasi da Salmonella typhimurium è veloce, semplice e breve. Il frazionamento del solfato di ammoniaca e la cromatografia ad esclusione dimensionale consentono di purificare il complesso di triptofano sintasi wild type e mutante in un solo giorno. Questa tecnica può essere applicata per purificare altre proteine correlate poiché il frazionamento del solfato di ammoniaca e la cromatografia ad esclusione dimensionale sono comunemente usati per purificare le proteine non marcate.

Per iniziare, disgregare il pellet cellulare mediante sonicazione su un bagno di acqua ghiacciata all'80% di ampiezza per 20 cicli utilizzando impulsi di 10 secondi e pause di 20 secondi. Centrifugare il lisato cellulare a 30.000 volte g per 30 minuti a 25 gradi Celsius e aspirare il surnatante senza rimuovere il pellet. Filtrare la frazione surnatante chiarificata con un filtro da 0,45 micrometri a temperatura ambiente.

Aggiungere lentamente piccole quantità di solfato di ammonio al filtrato fino a raggiungere il 20% di saturazione. Eseguire il frazionamento del solfato di ammonio a 25 gradi Celsius e mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti, facendo attenzione a evitare bolle. Centrifugare nuovamente la soluzione per 10 minuti e trasferire il surnatante in un pallone pulito per un ulteriore utilizzo.

Risospendere delicatamente il pellet in 20 millilitri di tampone di campionamento e preparare un campione per l'esecuzione di SDS-PAGE. Aggiungere solfato di ammonio al surnatante fino a raggiungere la saturazione del 30% e mescolare la soluzione, evitando bolle. Centrifugare nuovamente la soluzione per 10 minuti e trasferire il surnatante in un pallone pulito per un ulteriore utilizzo.

Risospendere delicatamente la frazione di pellet ottenuta al 40% in 10 millilitri di tampone campione due e preparare un campione per eseguire SDS-PAGE. Quindi microcentrifugare il campione di proteine al 40% a 10.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius e caricare il surnatante ottenuto su una colonna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR precedentemente bilanciata collegata a uno strumento di cromatografia liquida di proteine veloci a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto. Valutare le frazioni di picco raccolte e le frazioni di solfato di ammonio su un gel SDS-PAGE al 12% colorato con blu brillante Coomassie.

Concentrare il complesso di triptofano sintasi alfa-due beta-due di tipo selvatico o mutante con un filtro centrifugo da 100 kilodalton ruotando a 3.000 volte g, a quattro gradi Celsius. Trasferire la proteina concentrata in una provetta fresca da due millilitri e centrifugare nuovamente a 10.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi per rimuovere gli aggregati. Dopo aver determinato la concentrazione proteica del campione, preparare aliquote da 0,5 millilitri a 20-25 milligrammi per millilitro.

Congelali in azoto liquido e conservali a meno 80 gradi. Preparare una soluzione madre da cinque millilitri di spermina da 200 millimolari in acqua e conservarla in aliquote da 500 microlitri a meno 20 gradi. Quindi preparare una soluzione madre da 50 millilitri di polietilenglicole 8.000 al 30% in acqua e conservare 25 millilitri in un pallone conico da centrifuga monouso da 50 millilitri a 25 gradi Celsius.

Preparare soluzioni madre da 25 millilitri di cloruro di cesio e cloruro di sodio a un molare, ciascuna in acqua, e mantenerle a 25 gradi Celsius. Preparare tre serie di soluzioni madre da 50 millilitri di bicine monomolare e titolarle con idrossido di cesio o idrossido di sodio per ottenere soluzioni tamponate a pH 7,6, 7,8 e 8. Mantenere aliquote da 25 millilitri di soluzioni a quattro gradi Celsius.

Scongelare un campione di complesso alfa-due beta-due di Salmonella typhimurium triptofano sintasi in un bagno di ghiaccio. Quindi microcentrifugare a 10.000 volte g per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Trasferire la frazione surnatante limpida in una provetta da centrifuga pulita.

Stimare la concentrazione proteica del surnatante e diluire le aliquote a 15 milligrammi per millilitro con bidina idrossido di cesio bicina da 50 millimolari o idrossido di sodio bicina con pH 7,8, contenente cesio molare da 50 millimolari o cloruro di sodio. Preparare 500 microlitri di soluzioni di riserva per tre piastre a goccia da 24 pozzetti in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Variare la concentrazione di PEG 8, 000 e spermina e modificare il pH del tampone come descritto nel manoscritto del testo per ogni set.

Tappare le provette e agitare energicamente per 10 secondi, prima di centrifugarle a 10.000 volte g per 10 minuti a 25 gradi Celsius per rimuovere le bolle d'aria. Erogare 500 microlitri di questa soluzione in ogni serbatoio. Erogare cinque microlitri di soluzione proteica a 15 microgrammi per litro in ogni pozzetto di goccia seduta utilizzando una micropipetta P-10.

Quindi aggiungere cinque microlitri di ciascuna soluzione di serbatoio corrispondente alla goccia proteica. Evitare la formazione di bolle d'aria durante la miscelazione e non pipettare su e giù. Infine, copri la piastra con del nastro adesivo trasparente e conservala a 25 gradi.

I cristalli compaiono in due-cinque giorni e crescono fino alle loro dimensioni complete entro due settimane. Questo protocollo è stato utilizzato per sottoclonare la subunità alfa e la subunità beta della triptofano sintasi di Salmonella typhimurium nel vettore pET SUMO modificato. I risultati rappresentativi di SDS-PAGE di due bande forti corrispondenti alla proteina di fusione della triptofano sintasi His6-SUMO-alfa e His6-SUMO-beta sono mostrati qui.

Ogni proteina è stata purificata mediante cromatografia di affinità con acido nichel-nitrilotriacetico e precipitazione del solfato di ammonio, seguita dalla scissione di His-SUMO-tag, dalla rimozione delle tracce di His-SUMO-tag e dalla misurazione della concentrazione proteica. Qui sono mostrati il profilo di eluizione della subunità alfa, della subunità beta e del complesso alfa-due beta-due di Salmonella typhimurium triptofano sintasi su SEC e la purezza delle loro frazioni di picco. Dopo aver generato forme mutanti del complesso della triptofano sintasi, il frazionamento del solfato di ammonio è stato utilizzato per rimuovere le proteine contaminanti dal sistema di espressione eterologo.

Di seguito è mostrato un profilo di eluizione rappresentativo con una posizione di eluizione relativa del complesso alfa-due beta-due Salmonella typhimurium triptofano sintasi su una colonna cromatografica di esclusione. La purezza delle frazioni di picco escluse è stata analizzata utilizzando SDS-PAGE prima del pooling. Grandi cristalli singoli sono stati ottenuti attraverso un'ottimizzazione della cristallizzazione fine variando le concentrazioni di PEG 8, 000 e spermina e il pH del tampone bicina.

I cristalli con morfologie diverse sono apparsi in due-cinque giorni e sono cresciuti fino a raggiungere le dimensioni massime entro due settimane. La validazione delle mappe di densità elettronica per la struttura cristallina del complesso selvatico alfa-due beta-due Salmonella typhimurium triptofano sintasi è stata chiarita dopo il raffinamento della struttura cristallina. Quando si esegue questo protocollo, completare le fasi iniziali di purificazione a temperatura ambiente il prima possibile per prevenire la perdita di attività della triptofano sintasi.

Si prevede che le strutture cristalline dei mutanti forniranno nuove informazioni sul meccanismo e sul ruolo svolto dai residui chiave nella sintesi dell'L-triptofano.