Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Il protocollo è altamente efficiente e versatile. Può essere applicato a quasi tutte le proteine di membrana e l'intera procedura di produzione viene completata in un giorno. Le proteine di membrana sintetizzate possono essere stabilizzate già co-traduzionalmente dai ligandi forniti.

I contatti con i detergenti sono completamente evitati e le proteine si inseriscono e si ripiegano direttamente negli ambienti a membrana forniti e personalizzati. Gli approcci strutturali, la caratterizzazione funzionale e la generazione di anticorpi sono le principali aree di applicazione. La tecnica è inoltre semplice nell'analisi degli effetti lipidici sul ripiegamento e sulla funzione delle proteine di membrana.

Il terzo giorno di coltura, inoculare 10 litri di terreno YPTG sterile a 37 gradi Celsius in un reattore a serbatoio agitato da 15 litri con 100 millilitri di pre-coltura. E coltiva i batteri a 37 gradi Celsius con 500 giri al minuto in alta aerazione. Per evitare un'eccessiva formazione di schiuma, aggiungere un antischiuma sterile.

Quando le cellule raggiungono la fase di metà logaritmica, aggiungere 300 millilitri di etanolo alla coltura e incubare le cellule a 42 gradi Celsius con 500 rotazioni al minuto in alta aerazione per altri 45 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e utilizzare una spatola e una pipetta per risospendere completamente le cellule in 300 millilitri di tampone S30A. Centrifugare i batteri risospesi due volte, lavando il pellet con 300 millilitri di S30A fresco per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in un volume 1,1 di tampone S30B. Caricare le sospensioni in una cella di pressione pre-raffreddata a pressa francese e interrompere le celle a 1.000 libbre per pollice quadrato una volta. Per rimuovere eventuali componenti instabili e rilasciare l'mRNA dai ribosomi, regolare il lisato a 0,4 molari di cloruro di sodio e incubare il campione per 45 minuti in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius.

Per assemblare i nanodischi proteici dell'impalcatura di membrana, mescolare la soluzione MSP1E3D1 con la soluzione lipidica e aggiungere DPC a una concentrazione finale dello 0,1%Regolare la reazione al volume finale appropriato secondo la tabella e incubare le reazioni per un'ora a 21 gradi Celsius sotto leggera agitazione. Al termine dell'incubazione, pre-inumidire la membrana di una cassetta per dialisi con tampone discoformista e caricare la miscela di assemblaggio nella cassetta con una siringa. Successivamente, dializzare la reazione contro tre volumi da cinque litri di tampone per la formazione del disco per 10-20 ore a temperatura ambiente con agitazione prima di trasferire la miscela in unità filtranti centrifughe equilibrate per la formazione del disco e il tampone con un taglio del peso molecolare di 10 kilodalton.

Quindi concentrare la reazione ad almeno 300 micromolari mediante centrifugazione utilizzando un lettore UV-Vis per misurare la concentrazione. Per preparare una reazione senza cellule a scambio continuo da tre millilitri, equilibrare la membrana di una cassetta per dialisi da tre millilitri in tris-acetato da 100 millimolari. E usa una siringa per trasferire la miscela di reazione nella cassetta.

Utilizzando una siringa, rimuovere l'aria in eccesso dallo scomparto della miscela di reazione e posizionare la cassetta nella camera di dialisi. Riempire la camera con 60 millilitri di miscela di alimentazione e posizionare il coperchio sulla camera. Dopo aver fissato il coperchio in posizione, incubare la camera per 12-16 ore a 30 gradi Celsius in 200 giri al minuto.

Per preparare una configurazione di reazione senza cellule a scambio cellulare da 60 microlitri per lo screening degli ioni magnesio, aggiungere 60 microlitri del nostro 3X Master Mix appena preparato alla miscela di reazione e 825 microlitri alla miscela di alimentazione. E riempi la miscela di alimentazione con acqua. Dopo il vortex, aggiungere 825 microlitri di miscela di alimentazione a ciascuno dei tre pozzetti di una micropiastra a 24 pozzetti.

Tagliare le provette per dialisi in cellulosa rigenerata con un taglio di peso molecolare da 10 a 14 kilodalton in pezzi di circa 25 x 20 millimetri e conservare i pezzi in acqua integrata con azoturo di sodio allo 0,05%. Prima dell'assemblaggio del contenitore senza cellule, utilizzare un fazzoletto per rimuovere l'acqua in eccesso dalle membrane di dialisi e posizionare un pezzo di membrana su ciascun contenitore. Fissare le membrane con un anello di politetrafluoroetilene e trasferire il mini contenitore in un pozzetto della miscela di alimentazione.

Aggiungere i componenti ad alto peso molecolare alla miscela di reazione, come indicato nella tabella, e miscelare mediante pipettaggio. Aggiungere 60 microlitri di miscela di reazione nel contenitore di reazione, facendo attenzione a evitare bolle d'aria. E avvolgere due fogli di otto x 10 centimetri di una pellicola termoplastica sigillante attorno alla piastra a 24 pozzetti.

Fissare il coperchio della piastra a pozzetti in posizione con del nastro adesivo e posizionare la piastra a 30 gradi Celsius in 200 giri al minuto con agitazione per 12-16 ore. La mattina successiva, utilizzare la punta di una pipetta per perforare la membrana di dialisi nel contenitore privo di cellule a scambio minicellulare e aspirare la miscela di reazione. Trasferire la miscela di reazione in nuove provette da centrifuga e centrifugare per rimuovere i precipitati.

Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Qui viene mostrato un impatto rappresentativo dei composti di reazione fine-tuning sulla resa finale o sulla qualità delle proteine di membrana sintetizzate. In questa analisi, la sintesi complessiva e la solubilizzazione su nanodisco del recettore adrenergico T-beta-one erano simili in tutte le composizioni di membrana analizzate.

Al contrario, è stata rilevata una variazione molto più elevata nella qualità del recettore accoppiato a proteine G sintetizzate, con l'attività più bassa ottenuta con i lipidi DMPC e POPC e la più alta osservata quando sono stati applicati DOPG e POPG. Nel loro insieme, questi risultati indicano che la carica del gruppo della testa lipidica e la flessibilità della catena degli acidi grassi sono importanti modulatori per il ripiegamento e l'attività di questa proteina della membrana cellulare. La concentrazione finale del nanodisco può anche essere un fattore importante per la qualità delle proteine di membrana.

Ad esempio, se la concentrazione del nanodisco viene vagliata in un intervallo compreso tra 3,75 e 60 micromolari, si ottiene una solubilizzazione completa del recettore accoppiato alla proteina G a circa 30 nanodischi micromolari, fornendo un rapporto proteina-nanodisco di membrana da uno a tre. Al contrario, una solubilizzazione completa della proteorodopsina può essere ottenuta con circa 10 nanodischi micromolari, dando un rapporto proteorodopsina / nanodisco di 10 a uno. Un pipettaggio accurato e componenti di alta qualità sono certamente obbligatori.

Le fasi critiche per la preparazione del lisato sono la raccolta delle cellule nella fase di metà log e l'applicazione della fase ad alto contenuto di sale. La tecnica riduce drasticamente la complessità della sintesi proteica di membrana. Bersagli precedentemente impegnativi vengono sintetizzati in modo efficiente, consentendo così di lavorare su strutture molecolari di proteine finora inesplorate di rilevanza farmaceutica.