Name: Un modello di linfedema della coda murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Scopri un modello murino cronico di linfedema della coda per studiare il gonfiore da disfunzione linfatica. Questo metodo utilizza la nanotrasfezione tessutale per la somministrazione di materiale genetico e offre potenziali applicazioni terapeutiche.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni fornite dall'American Association of Plastic Surgeons Academic Scholarship e dal Dipartimento della Difesa W81XWH2110135   ad AHH. Borsa di studio della Aesthetic Surgery Education and Research Foundation a MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 e R01DK125835 a CKS.

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca animale dell'istituzione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Gli animali sono stati ospitati sotto un ciclo luce-buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
1. Interruzione chirurgica dei linfatici della coda di topo
<ol><li>Utilizzare topi C57BL/6 di otto settimane di equa distribuzione di genere.</li>
	<li>Posizionare un topo in anestesia generale in una camera di induzione con il 3-4% di isoflurano in ossigeno al 100% seguito da sedazione di mantenimento all'1-3% durante la procedura.</li>
	<li>Somministrare 0,5 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (SR) per via sottocutanea per il controllo del dolore. NOTA: Ulteriori farmaci analgesici somministrati dopo l'operazione: Carprofene una volta ogni 24 ore per almeno 48 ore e Bupivacaina una volta dopo l'incisione o prima di chiudere l'incisione, applicato gocciolando sui bordi della pelle (dura fino a 4 – 6 ore).</li>
	<li>Posizionare il topo dorsalmente e preparare la coda con il 70% di alcool isopropilico.</li>
	<li>Misurare il diametro della coda prima della procedura con incrementi di 5 mm a partire da 20 mm dalla base della coda utilizzando una pinza. Queste misurazioni saranno utilizzate per calcolare il volume utilizzando l'equazione del cono troncato37.</li>
	<li>Segnare un'escissione circonferenziale di 3 mm sulla coda a 20 mm dalla base.</li>
	<li>Eseguire una meticolosa escissione cutanea a tutto spessore di 3 mm con una lama chirurgica sterile (taglia 15), lasciando intatta tutta la vascolarizzazione sottostante sotto ingrandimento microscopico chirurgico. Incidere il segno circonferenziale superiore (20 mm dalla base della coda) prima attraverso il derma seguito da un'incisione circonferenziale a tutto spessore di 3 mm distlal alla prima incisione.<ol>
<li>Fare un'incisione verticale perpendicolare a tutto spessore per collegare le due incisioni. Utilizzare un pickup fine dentato per afferrare un bordo d'ingresso e utilizzare microscissori per sezionare attentamente in profondità all'interno del piano avascolare al derma e superficiale all'avventizia venosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare 0,1 mL di isosulfan blu (1%) per via sottocutanea prossimale alla punta della coda.</li>
	<li>Identificare i due canali linfatici adiacenti alle vene laterali della coda al microscopio chirurgico. I linfatici appariranno blu a causa dell'iniezione di isosulfan. Transect i linfatici usando forbici microchirurgiche dritte. Usa le forbici per sezionare attentamente un piano tra la vena laterale e il linfatico. Quindi passare la punta di una lama a forbice tra il vaso linfatico e la vena laterale e chiudere le lame per transect il vaso linfatico.</li>
	<li>Vestire la ferita della coda con una medicazione trasparente aderente sterile. Controllare quotidianamente le incisioni post-operatorie per assicurarsi che non siano infette o sanguinanti e fornire assistenza alle ferite per 2 settimane.</li>
	<li>Ospitare gli animali da solo per prevenire ulteriori lesioni alla coda e per impedire agli animali di mordersi a vicenda, il che porterebbe a complicazioni chirurgiche.</li>
</ol>2. Valutazione vascolare della coda con imaging laser a contrasto di macchie
<ol><li>Anestetizzare il mouse come nel passaggio 1.2.</li>
	<li>Per utilizzare l'imaging laser speckle contrast per visualizzare la vascolarizzazione della coda, impostare la larghezza su 0,8 cm, l'altezza su 1,8 cm, la densità dei punti su alta, la frequenza dei fotogrammi su 44 immagini al secondo, il tempo a 30 secondi e la foto a colori su 1 ogni 10 secondi.</li>
	<li>Valutare la perfusione venosa e arteriosa per la pervietà. Qualitativamente, la continuità del flusso dovrebbe essere visualizzata.</li>
</ol>3. Valutazione linfatica funzionale con angiografia laser nel vicino infrarosso
<ol><li>Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2</li>
	<li>Ricostituire il verde indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) e somministrare 0,1 mL per via sottocutanea nella coda distale del topo vicino alla punta.</li>
	<li>Attenua le luci della stanza. Posizionare l'angiografia laser nel vicino infrarosso in un'impostazione di buffering seguita dall'acquisizione dal vivo.</li>
</ol>4. Consegna focale del carico di acido nucleico alla coda del topo utilizzando TNT
<ol><li>Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2.</li>
	<li>Esfoliare la coda di topo usando una crema esfoliante topica per la pelle.</li>
	<li>Immergere la coda di topo in una soluzione di collagenasi (10 mg/mL) a 37 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Caricare il DNA nel serbatoio del chip TNT2.0 35.</li>
	<li>Posizionare il dispositivo con chip in silicone TNT2.0 sul sito focale di consegna desiderato sulla coda con nanonutrienti a contatto con la coda.</li>
	<li>Posizionare una sonda elettrica positiva nel serbatoio. Attaccare la sonda negativa a un ago da 30 G e inserire l'ago per via sottocutanea nella coda fino al luogo del parto.</li>
	<li>Applicare la stimolazione elettrica a impulsi a onda quadra (impulsi 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).</li>
</ol>

<ol><li>Kataru, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+secondary+lymphedema%3A+chicken+or+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Research%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg.</a> Translation Research. 209, 68-76 (2019).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse concorrenti.

Il linfedema è classificato come una lesione primaria (congenita) o secondaria (linfatica iatrogena)38,39. Il linfedema secondario comprende il 99% dei casi39. Il linfedema secondario è più comunemente causato da infezione (filariosi) o trattamento post-oncologico con linfoadenectomia o radiazione4,39. Un modello animale traslazionale è impegnativo per il linfedema secondario, poic...

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. L'arto interessato si allarga a causa dell'accumulo di liquidi, adiposi e fibrosi1. Il linfedema colpisce 250 milioni di persone in tutto il mondo2,3,4. Si stima che il 20-40% delle pazienti sottoposte a trattamento per tumori maligni solidi, come il cancro al seno, il melanoma, i tumori ginecologici/urologici, o i sarcomi, sviluppino linfedema 2,4,5. La morbilità da linfedema comprende infezioni ricorrenti, dolore e deformità6. Non esiste una cura per questa malattia progressiva e per tutta la vita. Le terapie attuali sono variaby efficace7 e comprendono compressione, terapia decongestionante completa da parte di fisioterapisti, procedure escissionali e operazioni microchirurgiche, tra cui il trasferimentodei linfonodi vascolarizzati e il bypass linfovenoso7,8,9,10,11,12,13,14. Il trattamento ideale per il linfedema deve ancora essere scoperto.
Lo studio del meccanismo e della terapia del linfedema è stato limitato. C'è un esordio ritardato medio di un anno dopo la lesione linfatica15,16 e la maggior parte degli individui che subiscono insulto iatrogeno con radiazioni e chirurgia non sviluppano linfedema4,6,17. Sebbene siano stati descritti modelli animali di grandi dimensioni, tra cui cani, pecore e maiali18,19,20,il modello di coda di topo è stato il più ampiamente applicato a causa della facilità, del costo e della riproducibilità. I modelli murini per lo studio del linfedema includono un modello di coda, ablazione linfatica mediata dalla diptheria-tossina e dissezione linfonodale ascellare o poplitea21,22,23,24,25,26. La maggior parte dei modelli di coda utilizza un'escissione cutanea focale a tutto spessore con clipping del canale linfatico che viene eseguita vicino alla base della coda22, con conseguente gonfiore della coda e caratteristiche istologiche simili al linfedema umano24,27,28,29. Tuttavia, il modello standard di coda murina si risolve tipicamente spontaneamente in appena 20 giorni ed è accompagnato da necrosi periodica della coda30. Il modello di coda di topo del linfedema estende un linfedema sostenuto oltre le 15 settimane, dimostra una pervietà arteriosa e venosa confermata e consente la valutazione della disfunzione linfatica funzionale.
Un modello di coda murina di linfedema consente la valutazione di nuove terapie per il trattamento del linfedema. Strategie basate su geni sono state utilizzate nel modello murino mediato da vettori virali31,32. Utilizziamo anche una nuova tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la consegna del carico genetico alla coda di topo linfedematosa. TNT facilita la consegna diretta e transcutanea del gene utilizzando un chip con nanocanali in un campo elettrico focalizzato rapido33,34,35,36. Il modello include l'utilizzo di TNT2.0 per consentire la consegna genica focale di potenziali terapie basate su geni al sito di lesione linfatica della coda di topo35.

<table><tbody><tr><td>Tegaderm Film</td><td></td><td>1626W</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>MSV266</td><td></td></tr><tr><td>Medicazione aderente (Tegaderm)</td><td>3M, St. Paul, Minn.</td><td>Speckle laser 1626W</td><td></td></tr><tr><td>(Pericam PSI System)</td> <td>Perimed AB, Stoccolma, Svezia)</td> <td>Laser PSIZ</td><td></td></tr><tr><td>nel vicino infrarosso (LUNA)</td> <td>Stryker (precedentemente Novadaq Technologies, Toronto, Canada)</td> <td>LU3000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 topi</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps - 1x2 denti</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc.</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>Gancio a V</td><td>Strumenti per la scienza fine (USA) Inc.</td><td>18052-12</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi SS NO15</td><td>Fischer Scientific</td><td>29556</td><td></td></tr><tr><td>Ago monouso 30GX1</td><td>Fischer Scientific</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-460-796</td><td></td></tr><tr><td>Pinza da chirurgo o gioielliere, Sklar 4-1/2 in</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-118-4255</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla - Dritto/Affilato-Affilato/ 8mm tagliente</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc.</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Cardiogreen</td><td>Sigma</td><td>I2633-25MG</td><td></td></tr><tr><td>IsosulfanBlue (Linfazurina)&nbsp; 50 mg/5ml</td><td>Mylan</td><td>67457-220-05</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di linfedema della coda murina

A Murine Tail Lymphedema Model

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. L'arto interessato si allarga a causa dell'accumulo di liquidi, adiposi e fibrosi. Non esiste una cura per questa malattia. Un modello di coda di topo che utilizza un'escissione cutanea focale a tutto spessore vicino alla base della coda, con conseguente gonfiore della coda, è stato utilizzato per studiare il linfedema. Tuttavia, questo modello può causare una vascolarizzazione e conseguente necrosi della coda e una risoluzione precoce del gonfiore della coda, limitandone la traducibilità clinica. Il modello di linfedema cronico della coda murina induce linfedema prolungato per 15 settimane e una perfusione affidabile alla coda. I miglioramenti del tradizionale modello di linfedema della coda murina includono 1) escissione precisa a tutto spessore e clipping linfatico utilizzando un microscopio chirurgico, 2) conferma della perfusione arteriosa e venosa post-operatoria utilizzando speckle laser ad alta risoluzione e 3) valutazione funzionale utilizzando linfangiografia laser a infrarossi verde indocianina. Utilizziamo anche la tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la nuova consegna non virale, transcutanea e focale del carico genetico alla vascolarizzazione della coda di topo.

La tecnica per il modello di coda di topo per il linfedema sostenuto è mostrata nella Figura 1. La figura mostra l'anatomia rilevante del modello di coda di topo. La Figura 2 mostra il gonfiore progressivo e il linfedema persistente prolungato nella coda del topo dopo l'induzione del linfedema. Il volume della coda del topo, come calcolato dall'equazione del tronco di cono, raggiunge il picco alla settimana 4 e si stabilizzano al...

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. Descriviamo un modello di coda murina cronica di linfedema e il nuovo uso della tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la consegna del carico genetico alla coda.

Un modello di linfedema della coda murina

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. The affected limb enlarges because of accumulation of fluid, adipose, and fibrosis. ...

Il linfedema è una condizione cronica senza cura. Colpisce un terzo dei pazienti che hanno subito un intervento chirurgico ai linfonodi ascellari e radiazioni nel trattamento del cancro al seno. Avere un modello animale valido facilita la comprensione del meccanismo e lo sviluppo di nuove strategie di trattamento.Il modello di coda di topo del linfedema è affidabile e riproducibile con l'insorgenza rapida. Presenta cambiamenti istologici coerenti con il linfedema umano. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Ganesh Mohan, un post-dottorato del mio laboratorio.Per iniziare, posiziona il topo sedato di otto settimane severamente e prepara la coda con alcool isopropilico al 70%. Utilizzare una pinza per misurare il diametro della coda con incrementi di cinque millimetri a partire da 20 millimetri dalla base della coda. Segna un'escissione circonferenziale di tre millimetri sulla coda a 20 millimetri dalla base.Sotto ingrandimento microscopico chirurgico, eseguire una meticolosa escissione cutanea a pieno spessore di tre millimetri lasciando intatta tutta la vascolarizzazione sottostante. Incidere il segno circonferenziale superiore prima attraverso il derma seguito da un'incisione circonferenziale a tutto spessore di tre millimetri distale alla prima incisione. Fare un'incisione verticale perpendicolare a tutto spessore per collegare le due incisioni, quindi utilizzare un pickup fine dentato per afferrare un bordo d'ingresso e sezionare in profondità all'interno del piano avascolare al derma e superficiale all'avventizia venosa con micro forbici.Iniettare 0,1 millilitro di blu isosulfan dell'1% per via sottocutanea prossimale alla punta della coda. Identificare i due canali linfatici che appaiono blu a causa dell'iniezione adiacente alle vene laterali della coda. Transect i linfatici con attenzione, sezionando un piano tra la vena laterale e il linfatico con forbici microchirurgiche dritte.Passare la punta di una lama a forbice tra il vaso linfatico e la vena laterale e chiudere le lame per transect il vaso linfatico. Al termine, vestire la ferita della coda con un indirizzo chiaro aderente sterile. Somministrare indocianina verde 0,1 millilitri per via sottocutanea nella coda distale del topo vicino alla punta.Attenuare le luci della stanza, quindi posizionare l'angiografia laser vicino all'infrarosso in un'impostazione di buffering ed eseguire l'imaging dal vivo. Dopo la somministrazione di blu isosulfan nella punta della coda, i linfatici hanno mostrato un colore blu. I linfatici sono stati interrotti mentre le vene laterali adiacenti sono state preservate.Il gonfiore progressivo e il linfedema persistente prolungato nella coda di topo dopo l'induzione del linfedema sono mostrati qui. Il volume della coda del topo, calcolato da un'equazione del tronco di cono, ha raggiunto il picco alla quarta settimana e si è stabilizzato alla sesta settimana, seguito da un graduale miglioramento che è stato sostenuto fino alla settimana 15. L'imaging laser ad alta risoluzione a contrasto di macchie è stato eseguito per confermare la perfusione della coda del topo nel modello di coda del linfedema che mostra vene laterali ferite e vene laterali intatte per la valutazione della pervietà della vascolarizzazione della coda.La linfangiografia laser nel vicino infrarosso ha dimostrato linfatici intatti preoperatori e nessun transito ICG oltre il sito chirurgico post-operatorio, confermando così che il gonfiore era causato dalla disfunzione linfatica. L'efficienza della consegna del carico genetico utilizzando la tecnologia di nanotrasfezione tissutale è stata dimostrata fornendo DNA etichettato con fluoresceina amidite alla coda murina. L'utilizzo di adattamenti per il modello di linfedema della coda di topo e l'angiografia laser nel vicino infrarosso ICG è un modello animale clinicamente traducibile ed eccitante con implicazioni terapeutiche.

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Un modello di linfedema della coda murina

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