Name: Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri la decellularizzazione del complesso cardiopolmonare murino per ottenere scaffold di matrice extracellulare con integrità strutturale. Questo metodo consente analisi biochimiche e anatomiche ad alta risoluzione.

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Ringraziamo la Prof.ssa Ivana Novak e la Dott.ssa Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Università di Copenaghen) per aver fornito l'accesso al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); una borsa di dottorato della Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); il Consiglio svedese della ricerca (2017-03389; CDM); la Swedish Cancer Society, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; CDM); Aiuto tedesco contro il cancro (Deutsche Krebshilfe; RR); e la Danish Cancer Society (R204-A12454; RR).

Tutte le procedure qui incluse sono state riviste e approvate dal comitato etico che regola la medicina sperimentale dell'Università di Copenaghen e concordano con la legislazione danese ed europea. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato topi BALB/cJ femmina di 8-12 settimane di età e un topo femmina MMTV-PyMT di 11 settimane di età.
NOTA: evitare la contaminazione batterica dell'impalcatura ECM decellularizzata offre il miglior risultato di imaging e consente la conservazione a lungo termine del campione. È quindi importante mantenere sterili tutti i passaggi. Pertanto, tutti gli strumenti e il materiale chirurgico, tra cui sutura, micro-sutura, soluzioni, tubi, connettori Luer e cateteri, devono essere sterili. Le superfici, incluso un vassoio in polistirolo, devono essere disinfettate con etanolo al 70% e la perfusione deve essere effettuata preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Tutte le procedure si svolgono a temperatura ambiente se non diversamente indicato.
1. Microchirurgia post mortem
<ol><li>Eutanasia del mouse utilizzando una camera a CO2 .<ol>
<li>Posizionare il mouse in una camera da 4 L e iniziare a riempire con CO2 al 100%, a partire da 0,2 L / min per 2 minuti, aumentando fino a raggiungere un flusso di 0,8 L / min dopo 3 minuti. Il topo dovrebbe perdere conoscenza durante i primi 2 minuti, e poi la respirazione dovrebbe cessare (di solito circa 5 minuti, ma il flusso può essere mantenuto se necessario). Conferma la morte prima di procedere al passaggio successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rasare il torace, l'addome e la parte posteriore del topo con il tagliacapelli e disinfettare con etanolo al 70%. La rasatura riduce notevolmente il numero di artefatti a causa della presenza di capelli su campioni per l'imaging o l'analisi biochimica.</li>
	<li>Fissare il mouse a un vassoio in polistirolo, estendendo gli arti anteriori e posteriori, nonché la testa e la coda. Mettilo sotto il microscopio microchirurgico.</li>
	<li>Utilizzando una forbice a modello dritto Mayo stabilire l'accesso chirurgico con un'incisione cutanea che va dalla regione sottomandibolare all'addome inferiore e sezionare per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.</li>
	<li>Usando le forbici microchirurgiche, tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica.</li>
	<li>Usando forbici a modello dritto, tagliare lo sterno lungo le incisioni precedenti, quindi completare una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo, quindi elevare e fissare entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.</li>
	<li>Usando micro-pinze a punta rotonda (o micro-pinze di Dumont), asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. Questo rivelerà le navi principali.</li>
	<li>Usando la cauterizzazione, cauterizzare la vena cava discendente e, usando forbici a modello dritto, tagliare l'esofago.</li>
	<li>Usando micro-pinze affilate, separare le vene brachiocefaliche e quelle brachiocefale, le arterie carotidi e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione.</li>
	<li>Usando il supporto del micro-ago, la micro-pinza affilata e la sutura 9-0 posizionano i punti sopra l'emergere delle arterie brachiocefale, carotidi comuni e succlavia sinistra.</li>
	<li>Cauterizzare le vene brachiocefaliche.</li>
	<li>Separare le ghiandole salivari sottomandibolari lungo la linea mediana per esporre i muscoli del collo e la trachea. Separare i muscoli per esporre il legamento cricotiroideo. Usando micro-forbici, apri un ingresso sezionando il legamento.</li>
	<li>Introdurre un catetere da 27 G nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea si ramifica nei bronchi (cioè, fino a quando non viene raggiunta la resistenza al catetere, quindi ritirarsi di 3 mm). Fare attenzione a non interrompere i bronchi. Usando una sutura 6-0, posizionare 3 punti attorno alla trachea per fissare il catetere.</li>
	<li>Sezione il topo all'altezza della 12a vertebra toracica. L'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Distingui la metà inferiore.</li>
	<li>Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Usando la sutura 9-0, posizionare 4 punti intorno all'aorta, iniziando 5 mm sotto la punta del catetere.</li>
</ol>2. Decellularizzazione
<ol><li>Collegare il mouse a un sistema di pompe utilizzando tubi in silicone e connettori Luer. Perfondere con acqua deionizzata a 200 μL/min per 15 min. Mantenere questa portata durante la decellularizzazione.</li>
	<li>Cambiare l'agente di perfusione allo 0,5% di sodio desossicolato (DOC) diluito in acqua deionizzata e perfondere durante la notte.</li>
	<li>Modificare l'agente di perfusione allo 0,1% di sodio dodecilsolfato (SDS) diluito in acqua deionizzata e perfondere per 8 ore.</li>
	<li>Perfondere con acqua deionizzata durante la notte per lavare via SDS e DOC per 24 ore.</li>
	<li>Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attaccamenti al torace usando una forbice curva e conservare in un criotubo sterile con acqua deionizzata con l'1% (v / v) di penicillina-streptomicina e 0,3 μM di azide di sodio a 4 ° C. Gli scaffold ECM possono essere conservati per almeno 12 settimane1. Se l'impalcatura verrà utilizzata per l'analisi biochimica (ad esempio, la spettrometria di massa), il congelamento a scatto in azoto liquido.</li>
</ol>3. Immunocolorazione
<ol><li>Pianificare l'imaging: determinare l'anticorpo primario (o anticorpi) e la combinazione di anticorpi secondari coniugati fluorescentemente per abbinarsi tra loro e adattarsi alle linee laser del microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Bloccare il campione immergendolo in un criotubo contenente il 6% (v/v) di siero d'asino - il 3% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) durante la notte.</li>
	<li>Incubare con anticorpi primari (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.</li>
	<li>Lavare 5 volte per 1 ora ogni volta in 0,05% interpolazione 20 in PBS (PBST).</li>
	<li>Incubare il campione con anticorpi secondari coniugati fluorescenti (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.</li>
	<li>Lavare 5 volte per 1 ora nello 0,05% (PBST). Attendere 1 ora tra ogni lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere acqua deionizzata e conservare a 4 °C al riparo dalla luce diretta. A questo punto, l'impalcatura è pronta per l'immagine.</li>
</ol>4. Imaging
<ol><li>Posizionare il campione in un piatto con fondo di vetro e umidificarlo con due goccioline di soluzione di conservazione (PBS o acqua deionizzata).</li>
	<li>Prepara l'obiettivo. Si consiglia di utilizzare un obiettivo di immersione in acqua.</li>
	<li>Ispezionare il campione utilizzando la luce a fluorescenza.</li>
	<li>Passare al controllo del computer. Accendi i laser e regola l'intensità del laser, l'apertura stenopeica, le lunghezze d'onda dei rilevatori, il guadagno, la risoluzione e lo zoom. Imposta il numero e la dimensione del passo per z-stack e inizia l'acquisizione. Si consiglia di utilizzare l'eccitazione laser multifotonica per aumentare la penetrazione dei tessuti e ridurre al minimo la dispersione della luce, lo sbiancamento e il danno tissutale.</li>
</ol>5. Colorazione dell'ematossilina-eosina
<ol><li>Asportazione 1 lobo polmonare da un topo eutanasizzato.</li>
	<li>Posizionare in un criostampo di 10 mm x 10 mm x 5 mm e coprirlo con circa 500 μL di composto OCT.</li>
	<li>Congelare su ghiaccio secco (-70 °C) e mantenere il campione a tale temperatura.</li>
	<li>Asportare un lobo polmonare decellularizzato da un topo trasformato secondo il passaggio 2.5.</li>
	<li>Porre in un criostampo con la superficie più grande verso il basso e coprirlo con un composto OCT come specificato al punto 5.2.</li>
	<li>Congelare su ghiaccio secco (-70°C) e mantenere il campione a quella temperatura fino a quando non sarà altrimenti richiesto. Il campione può essere conservato per almeno 12 settimane.</li>
	<li>Sezione blocchi di tessuto congelato a -20 °C in un criostato con spessore di 5 μm e posizionare sezioni su vetrini adesivi e conservare a -80 °C.</li>
	<li>Portare le diapositive a temperatura ambiente fino a quando non si asciugano all'aria (circa 20 minuti).</li>
	<li>Immergere brevemente in PBS e fissare immergendo i vetrini nel 4% di paraformaldeide in PBS per 15 min. Lavare una volta in PBS per 5 minuti, quindi due volte in acqua distillata per 5 minuti.</li>
	<li>Immergere nella soluzione di ematossilina di Mayer per 10 minuti. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.</li>
	<li>Lavare in un barattolo coplin sotto acqua distillata corrente per 10 minuti.</li>
	<li>Immergere in soluzione di eosina per 7 min. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.</li>
	<li>Immergere in etanolo al 50% per rimuovere l'eccesso di Eosina e disidratarlo immergendo brevemente in etanolo al 70% e in etanolo al 96% e al 100% per 30 secondi. Immergere nello xilene più volte.</li>
	<li>Applicare alcune gocce di supporto di montaggio DPX e posizionare una copertura in vetro.</li>
	<li>Lasciare asciugare le diapositive durante la notte sotto un cappuccio chimico.</li>
	<li>Scansione delle diapositive in uno scanner di diapositive.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche di decellularizzazione basate sull'agitazione tissutale alterano la struttura dell'ECM, rendendole inadatte all'analisi della struttura ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l'aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l'organo. L'uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è segnalat...

L'ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l'ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l'ECM del topo, poiché i topi sono l'organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.
Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolare l'ECM2 nativo associato alle metastasi. Poiché i tumori mancano di un'adeguata vascolarizzazione anatomica e i topi sono organismi relativamente piccoli, le procedure microchirurgiche sono state progettate per cateterizzare retrogradamente l'aorta, isolando la circolazione del vaso principale che porta a un tumore (ad esempio, le vene polmonari), focalizzando così il flusso di reagenti e consentendo la decellularizzazione del tumore. Questo metodo produce scaffold ECM con una struttura conservata2 che possono essere immunocolorati e ripresi, consentendo la mappatura della struttura ECM nei dettagli submicronici. Per realizzare questo protocollo è necessario acquisire competenze chirurgiche e microchirurgiche (dissezione, microsuturazione e cateterizzazione) che possono rappresentare una potenziale limitazione al suo utilizzo. Per quanto ne sappiamo, questo metodo rappresenta lo stato dell'arte per l'analisi nativa della struttura ECM2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura, ago a sezione triangolare (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 micro-sutura (Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Adson con denti</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Porta microaghi Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>n. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 camera di ventilazione per l'eutanasia del topo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio monouso in polistirene (~30 &volte; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione (Greenough, con collo d'oca a due bracci)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Microspatola a doppia estremità</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont micropinze (due)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Micropinze Dumont con 45&deg; tips (two)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Halsey (con ganasce in carburo di tungsteno)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Catetere endovenoso calibro 24 (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>Catetere endovenoso calibro 26 (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mayo (taglio duro, dritto)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Micropinze con punte ad anello (due)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a micromolla (Vannas, curve)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>Aghi (calibro 27; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Tovagliolo di carta (sterile) o tovagliolo chirurgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici seghettate (CeramaCut, dritte)</td><td>Spatola Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>(Freer-Yasargil)</td><td>Siringhe Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe (10 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Forbici tendinee (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-cavia IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 asino anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina frazione bovina V, grado standard, liofilizzato)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale al collagene IV (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Ospite: coniglio</td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10&volte;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Host:</td></tr><tr><td>anticorpo policlonale periostina di capra (un gentile regalo di Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Ospite: cavia Bisturi</td></tr><tr><td>monouso con lama n.11 (pz. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Siero (siero d'asino normale)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Rivelatori (rivelatori ibridi (Leica, modello HyD S) e tubi fotomoltiplicatori (PMT; )&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sorgente luminosa a fluorescenza&nbsp;</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microscopio (microscopio multifotone invertito)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Obiettivo (lambda blu, 20&times;, 0,70 apertura numerica (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ti&ndash; a due fotoni laser allo zaffiro (Spectra-physics, modello Mai Tai DeepSee)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Laser a luce bianca (WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DECELLULARIZZAZIONE</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo (alcol assoluto 99,9%); l'alcol assoluto deve essere regolato al 70% (vol/vol) utilizzando acqua deionizzata.</td><td>Prugna</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata (Milli-Q IQ 7000, sistema di acqua di laboratorio ultrapura)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi maschio Luer-to-tubing (1/8 di pollice)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10&, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica (con 12 canali)</td>Tubo in silicone <td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>(con diametro interno di 2 mm e diametro esterno di 4 mm)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato (DOC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E COLORAZIONE</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific 15434389</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96% etanolo</td><td>prugna</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>etanolo assoluto</td><td>prugna</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti (24x50mm; 1000 pezzi)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds intermedio (15 x 15 x 5 mm; 100 pezzi)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX mezzo di montaggio</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y soluzione alcolica 0,5%</td><td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo Feather acciaio inossidabile,C35 (50 pezzi)</td><td>Pfm medical</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Vetrini Superfrost Plus (25 x 75 mm; 144 pezzi)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers ematossilina</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT composto</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Scanner per vetrini (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

decellularizzazione del complesso cardiopolmonare murino

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l'aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L'intera procedura può essere completata in 4 giorni.
Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L'assenza di cellule consente l'esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell'ECM associato alla malattia cardiopolmonare.

Decellularizzazione cardiopolmonare Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni, così come il tessuto annesso come l'arco aortico, saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione ematossilina-eosina (Figura 1) degli scaffold ECM che mostrano la rimozione dei nuclei rispetto al tessuto nativo. Queste impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua stru...

Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.

Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Questo protocollo è la porta d'accesso alla matrice extracellulare. È la complessità e la sua struttura fino alla scala sub micron. Quindi il vantaggio principale di questo metodo è che consente di ottenere una matrice extracellulare che mantiene la sua integrità strutturale aprendo così la strada all'analisi biochimica e anatomica.A dimostrare la procedura saranno, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten e Maria Rafaeva, attualmente nel mio laboratorio e Chris Madsen e che era nel mio laboratorio e ha continuato il lavoro all'Università di Lund. Inizia radendo il torace, l'addome e la parte posteriore del topo eutanasizzato con un tagliacapelli. Disinfettare l'area con il 70% di etanolo.Quindi appuntare il mouse su un vassoio di polistirolo, estendendo i suoi quattro arti posteriori terminali, così come la testa e la coda. Mettilo sotto il microscopio microchirurgico. Usando una forbice a modello dritto Mayo, fai un'incisione cutanea che va dalla regione sottondibolare all'addome inferiore e seziona per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.Quindi utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica. Tagliare lo sterno lungo le incisioni precedenti con forbici dritte. Quindi completare una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo.Elevare e fissare, entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare. Utilizzare micro pinze a punta rotonda per asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. E tagliare l'esofago con micro forbici.Separare le vene brachiocefaliche e l'arteria brachiocefalica con micro pinze affilate. Quindi separare le arterie carotidi comuni sinistre e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione. Utilizzare un portaaghi e micro pinze affilate e una sutura a nove oh per posizionare punti sopra l'emergere delle arterie carotidi comuni brachiocefaliche e succlavia sinistra, cauterizzare le vene brachiocefaliche.Usando micro forbici, apri un ingresso sezionando il legamento. Introdurre un catetere calibro 27 nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea si ramifica nei bronchi, facendo attenzione a non disturbare i bronchi. Usando una sutura a sei O, posizionare tre punti attorno alla trachea per fissare il catetere.Sezione il topo all'altezza della 12a vertebra toracica, l'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Usando una sutura, posizionare quattro punti intorno all'Aorta, iniziando cinque millimetri sotto la punta del catetere.Collegare il mouse a un sistema di pompe utilizzando tubi in silicone e connettori inferiori. Perfondere con acqua deionizzata a 200 microlitri al minuto per 15 minuti. Quindi cambiare l'agente di perfusione allo 0,5% DOC, diluito in acqua deionizzata e perfondere durante la notte.Il giorno successivo, cambiare l'agente di perfusione allo 0,1% di SDS diluito in acqua deionizzata e perfondere per otto ore. Quindi perfondere con acqua deionizzata per 24 ore per lavare via la SDS e la DOC. Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attaccamenti al torace.Conservare il tessuto in un tubo crio sterile in acqua deionizzata con l'1% di penicillina streptomicina e 0,3 micromolare di sodio azide a quattro gradi Celsius. Per eseguire la colorazione immunologica, bloccare il campione incubandolo in una criotuba contenente il 6% di siero d'asino e il 3% di BSA durante la notte. Quindi incubare con anticorpo primario in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.Dopo l'incubazione lavare il campione cinque volte in PBST per un'ora per lavaggio. Incubare il campione con anticorpi secondari coniugati fluorescenti in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore. Quindi ripetere i lavaggi in PBST.Aggiungere l'acqua ionizzata e conservare il campione a quattro gradi Celsius lontano dalla luce diretta. Per visualizzare il campione, metterlo in un piatto con fondo di vetro e umidificarlo con due goccioline di soluzione di conservazione. Impostare l'obiettivo e ispezionare il campione utilizzando la luce a fluorescenza.Passa al controllo del computer, accendi i laser e regola l'intensità del laser, l'apertura stenopeica, la lunghezza d'onda dei rilevatori, il guadagno, la risoluzione e lo zoom. Imposta il numero e la dimensione del passo per lo stack Z, quindi inizia l'acquisizione. Asportare un lobo polmonare da un topo eutanasizzato e metterlo in uno stampo criometrico da 10 per 10 per cinque millimetri.Coprilo con circa 500 miglia di microlitri di composto OCT e congelalo su ghiaccio secco. Mantenere il campione a quella temperatura. Asportare un lobo polmonare decellularizzato da un topo lavorato, posizionarlo in uno stampo criometrico con la superficie più ampia verso il basso e coprirlo con composto OCT.Congelare il campione su ghiaccio secco e mantenerlo a quella temperatura fino a quando non sarà altrimenti richiesto. Il campione può essere conservato per almeno 12 settimane. Utilizzare un criostato per sezionare blocchi di tessuto congelato in cinque sezioni di micrometri a meno 20 gradi Celsius.E posiziona le sezioni su vetrini adesivi. Trasferire le diapositive a temperatura ambiente fino a quando non si asciugano all'aria. Immergere brevemente le diapositive in PBS, seguito da 4% paraformaldeide in PBS per 15 minuti.Lavare una volta in PBS, poi due volte in acqua distillata per cinque minuti per lavaggio. Immergere i vetrini nella soluzione di ematossilina di Myer per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini in un barattolo Copeland sotto acqua distillata corrente per 10 minuti e immergere in soluzione di eosina per sette minuti.Immergere nello xilene più volte. Applicare alcune gocce di supporto di montaggio DPX e posizionare un coperchio di vetro. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte sotto un cappuccio chimico, quindi scansionarli in uno scanner a vetrini.Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni e il tessuto NX saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione dell'ematossilina eosina degli scaffold ECM. Le impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua struttura ECM insoliable è intatta.Gli scaffold ECM hanno mostrato una maggiore permeabilità e penetrabilità della luce. L'utilizzo di questo protocollo con uno stadio di microscopio motorizzato consente l'imaging tridimensionale piastrellato di campioni a montaggio intero con risoluzione inferiore al micron. È essenziale evitare il flusso verso gli organi di interesse per ottenere una decellurizzazione uniforme completa.La dissezione microchirurgica e la legatura dei vasi devono essere efficaci. E allo stesso tempo rispettare i tessuti bersaglio per mantenere la struttura VCM nativa. Seguendo questa procedura, gli scaffold saranno arricchiti per proteine ECM strutturali e potranno essere utilizzati per la spettrometria di massa o l'ingegneria tissutale.Questa tecnica apre la strada alla mappatura ad alta risoluzione della matrice extracellulare.

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