Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti
18 marzo 2021
Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare un'impalcatura utilizzando reni di ratto decellularizzati. Il protocollo include processi di decellularizzazione e ricellularizzazione per confermare la biodisponibilità. La decellularizzazione viene eseguita utilizzando Tritone X-100 e solfato di dodecil di sodio.
Questo protocollo consente di sviluppare impalcature vascolarizzate utilizzando reni in un modello di ratto. Il rene è l'organo più adatto per impalcature di cellule staminali differenziate. Questo è un protocollo di grande successo per la decellularizzazione del rene.
Rimuove efficacemente i nuclei con la minima distruzione dell'ultrastruttura ECM. Questa tecnica può essere applicata alla medicina dei trapianti e all'ingegneria tissutale. A dimostrare la procedura sarà Kim Joo Hyoung, professore associato di chirurgia plastica del mio laboratorio.
Per iniziare, posizionare il ratto Sprague Dawley di otto settimane su un tampone riscaldante e posizionare una sonda termometro rettale nel retto per monitorare la temperatura interna. Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo in posizione supina e fissare i quattro arti al tavolo con del nastro adesivo. Radere e pulire l'addome con sapone germicida.
Applicare il 2%Betadine per almeno uno o due minuti, quindi pulirlo con una soluzione di etanolo al 70%. Ripetere questa sequenza tre volte. Coprire il campo operatorio con un drappo sterile e fenestrato.
Fai un'incisione addominale verticale ed esponi il rene sinistro, l'utere, l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Sezionare il tessuto poco prima di tagliare il pedicolo. Preparare 50 millilitri di soluzione perfusione per ratto mescolando PBS con circa 10 unità per millilitro eparina.
Mescola volumi uguali dell'8%PFA con PBS per creare la soluzione PFA al 4%. Estendere l'incisione addominale verticale cranicamente, assicurandosi di disegnare le forbici lontano dagli organi durante il taglio per evitare danni. Continuare l'incisione attraverso la gabbia toracica, quindi tagliare attraverso il diaframma sollevando lo sterno.
Ritrai il lembo sciolto della pelle con un morsetto Allis e libera il cuore strappando qualsiasi tessuto connettivo con le pinze. Aprire la linea PBS e assicurarsi che fluisco prima di posizionare l'ago nel ventricolo sinistro. Tenere delicatamente il cuore con pini smussati e utilizzare un emostato per controllare l'ago.
L'ago deve essere inserito non più di un quarto di pollice. Mentre si sostiene il cuore con l'ago e l'emostato, individuare l'atrio destro e tagliarlo attraverso di esso con forbici per iridectomia. Appoggia l'emostato sul corpo del topo e assicurati che l'ago sia ancora posizionato all'interno del cuore.
Continuare a perfondere PBS per quattro minuti o più se c'è ancora sangue visibile nel rene e nel fegato. Raccogliere il rene sinistro con l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Ligate l'urigatore, l'aorta toracica, la vena cava superiore e i rami dell'aorta addominale.
Mantenere l'organo idratato in DPBS in una piastra di Petri di 10 centimetri. Cannulate l'aorta addominale e la vena cava inferiore con un catetere calibro 23. Per rimuovere il sangue residuo, collegare la cannula con una pompa peristaltica e lavare l'organo con 500 millilitri di DPBS e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti a cinque giri/min e 37 gradi Celsius.
Per decellularizzare il rene, perfonderlo con 1%Triton X-100 per tre ore e quindi con una soluzione di SDS dello 0,75% per sei ore a una pressione costante di 40 millilitri di mercurio. Per rimuovere l'SDS residuo, perfondere il campione con 1%penicillina in acqua distillata per 18 ore e quindi con DPBS sterile e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti. La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro.
Dopo la decellularizzazione, il rene divenne pallido e traslucido. Il DNA genomico residuo è stato quantificato in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello dei reni nativi, confermando che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizzazione. Da 14 casi, il contenuto medio di DNA era di 115,05 nanogrammi per microlitro per il controllo e 1,96 nanogrammi per microlitro per l'impalcatura decellularizzata.
In totale, il 98,3% del DNA è stato rimosso. La struttura tridimensionale fu mantenuta, e i glomeruli acellulari furono conservati nel parenchima corticale. Quando si inserisce l'ago nel ventricolo sinistro, deve essere inserito non più di un quarto di pollice.
Qualsiasi ulteriore inserimento può uscire dall'altra parte. Siamo confidiamo che questa tecnica aprirà una nuova prospettiva nel campo dell'ingegneria tissutale.
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Panoramica
Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare scaffold vascolarizzati utilizzando reni di ratto decellularizzati. La tecnica rimuove efficacemente i nuclei preservando l'ultrastruttura della matrice extracellulare (ECM), rendendolo adatto per la medicina dei trapianti e l'ingegneria dei tessuti.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Ingegneria dei tessuti
- Medicina dei trapianti
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- Il rene è un organo ideale per gli scaffold di cellule staminali differenziate.
- La decellularizzazione è cruciale per creare scaffold che mantengono la struttura della ECM.
- Questo protocollo ha un grande successo nel raggiungere un'efficace decellularizzazione.
- Utilizza Triton X-100 e sodio dodecilsolfato per il processo di decellularizzazione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per creare scaffold renali vascolarizzati.
- Dimostrare i processi di decellularizzazione e ricellularizzazione.
- Esplorare le applicazioni in trapianto e ingegneria dei tessuti.
Metodi utilizzati
- Decellularizzazione utilizzando Triton X-100 e sodio dodecilsolfato.
- Valutazione della biodisponibilità attraverso processi di ricellularizzazione.
- Dimostrazione da parte di un professore associato MD/PhD di chirurgia plastica.
- Applicazione del protocollo in un modello di ratto.
Risultati principali
- Rimozione con successo dei nuclei con danni minimi alla ECM.
- Creazione di uno scaffold adatto alla differenziazione delle cellule staminali.
- Potenziale di utilizzo in applicazioni cliniche di trapianto.
- Dimostrazione dell'efficacia del protocollo in ambiente di laboratorio.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce una base per la futura ricerca nell'ingegneria dei tessuti.
- Aprirà strade per lo sviluppo di scaffold funzionali di organi.
- Sono necessari ulteriori studi per ottimizzare le tecniche di ricellularizzazione.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Decellularized organ scaffolds provide a critical platform for evaluating stem cell differentiation and tissue regeneration in preclinical models. This method enables mechanistic de-risking of vascularized tissue constructs by preserving extracellular matrix architecture while removing immunogenic cellular components. The approach supports target validation in regenerative medicine by establishing disease-relevant systems for assessing scaffold-host integration and functional tissue formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell-scaffold interactions in a vascularized kidney microenvironment.
- Operational Value: Provides a reproducible decellularization protocol for generating acellular organ scaffolds with preserved ultrastructure.
- Scientific Value: Supports assessment of extracellular matrix integrity as a predictor of scaffold suitability for recellularization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized vascularized scaffolds for quantifying stem cell attachment, proliferation, and differentiation.
- Operational Value: Establishes perfusion-based decellularization workflows suitable for scaling across multiple organ models.
- Scientific Value: Enables DNA quantification as a quality control metric for decellularization efficiency (>98% removal demonstrated).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of vascularized scaffold integration in vivo, supporting preclinical validation of organ graft potential.
- Operational Value: Maintains three-dimensional structural integrity and glomerular architecture for disease-relevant functional testing.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying host-scaffold remodeling and vascular perfusion dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions decellularized scaffold generation as an enabling step between stem cell sourcing and preclinical tissue engineering validation, supporting lead identification in regenerative therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding stem cell fate decisions on organ-specific extracellular matrices.
- Screening: Describes perfusion-decellularization as a standardized preparation step for generating assay-ready vascularized scaffolds.
- Analytics: Highlights genomic DNA quantification as a critical readout for assessing decellularization completeness and scaffold quality.
- Translational Research: Connects scaffold preparation to preclinical continuity by preserving vascular channels and glomerular structures for functional assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable decellularization platform applicable to multiple organ systems for pipeline-wide target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in scaffold biocompatibility through preservation of extracellular matrix ultrastructure and vascular architecture.
- Operational Value: Standardized perfusion protocol ensures reproducibility across laboratories and supports technology transfer.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early assessment of scaffold-host integration and immunogenicity profiles.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of regenerative candidates by providing quantitative metrics for scaffold suitability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical perfusion techniques and organ dissection.
- Dependent on perfusion equipment capable of maintaining constant pressure (40 mmHg) and flow rates.
- Necessitates standardized solutions for detergents (Triton X-100, SDS) and anticoagulants (heparin) to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations for different organ sizes and vascular architectures when extending beyond rat kidneys.
- Practical limitation: prolonged detergent exposure risks extracellular matrix damage if not optimized per tissue type.
