Name: Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri come misurare il flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale. Questa tecnica avanzata permette di studiare le dinamiche vascolari in condizioni normali e patologiche.

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Questa ricerca è stata supportata da NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation della Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

NOTA: Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oregon Health & Science University (numero di approvazione IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza
<ol><li>Anestetizzare i topi donatori (topi maschi C57BL/6J di età ~6 settimane) con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di soluzione anestetica ketamina/xilazina (5 ml/kg, vedere la Tabella dei Materiali). NOTA: Questo protocollo di anestesia è molto affidabile e mantiene la pressione sanguigna sistemica.</li>
	<li>Appoggiare il mouse sulla schiena, aprire la pelle ed esporre la cavità toracica usando pinzette e forbici da dissezione. Tagliare il diaframma, afferrare alla base dello sterno usando le forbici a morsetto, tagliare la gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Raccogliere 1 mL di sangue nell'eparina (15 UI/mL di sangue) mediante puntura cardiaca e centrifugare a 3.000 × g per 3 minuti a 4 °C. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale dopo la raccolta del sangue.</li>
	<li>Rimuovere il plasma, lavare il pellet delle cellule del sangue con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Etichettare le cellule del sangue con 1 mL di 20 mM DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente23,24.</li>
	<li>Centrifugare e lavare le cellule del sangue marcate con 1 mL di PBS, centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con ~0,9 mL di PBS (volume finale ~1,3 mL) prima dell'iniezione.</li>
</ol>2. Intervento chirurgico per creare una finestra aperta 25
<ol><li>Preparare gli strumenti chirurgici sterili e la piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo (Figura 1A). Anestetizzare i topi (topi maschi C57BL / 6J di età ~ 6 settimane) come descritto al punto 1.1 e controllare la profondità dell'anestesia monitorando il riflesso della zampa e il tono muscolare generale. Posizionare l'animale sul termoforo caldo e mantenere la temperatura rettale a 37 °C.</li>
	<li>Posizionare la coda dell'animale nel sistema di monitoraggio CODATM per monitorare la pressione sanguigna e il battito cardiaco (vedere la tabella dei materiali). Registrare la pressione arteriosa sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media (MBP) nella condizione anestetizzata. NOTA: Nessuna differenza è osservata nella MBP animale nello stato anestetizzato e non anestetizzato (107 ± 11 mmHg vs 97 ± 7 mmHg). La frequenza cardiaca animale è stabile sotto anestesia, anche se inferiore (ancora entro il range di normalità) rispetto alla condizione non anestetizzata (357 ± 12 bmp vs 709 ± 3 bmp). Un leggero aumento del battito cardiaco dovrebbe essere previsto negli animali posti in contenzione26.</li>
	<li>Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e ventrale al microscopio stereoscopico (vedi la Tabella dei Materiali), lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini21.<ol><li>Fare un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata e posizionata per ridurre al minimo il movimento (Figura 1B). Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare. NOTA: iniettare per via sottocutanea buprenorfina a 0,05 mg/kg per ridurre il dolore durante l'intervento chirurgico.</li>
		<li>Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla.</li>
		<li>Aprire la bolla ossea con un ago da 30 G e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara della coclea e dell'arteria stapediale, con il margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e scorre anteriore-superiore verso la finestra ovale (Figura 1C, D). NOTA: La tracheotomia viene eseguita per mantenere le vie aeree libere e deve essere eseguita solo quando l'animale ha un problema respiratorio durante l'intervento chirurgico. In generale, la maggior parte degli animali sotto anestesia ha una respirazione regolare. Tuttavia, se gli animali hanno ricevuto una tracheotomia durante l'intervento chirurgico, il flusso sanguigno registrato non deve essere utilizzato per alcun confronto.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare una piccola lama di coltello (bisturi #16 fresato su misura) per raschiare l'osso della parete laterale all'apice-giro medio della coclea del topo, a circa 1,25 mm dall'apice fino a quando non si rompe un punto sottile. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici (Figura 1E).</li>
	<li>Coprire la finestra della nave con un coprislip tagliato per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave. NOTA: tutte le procedure devono essere eseguite con cautela. Oltre a monitorare la temperatura corporea, anche i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.</li>
</ol>3. Imaging di CoBF sotto FIVM
<ol><li>Fare un'incisione di ~ 1 cm lungo la vena safena destra per esporre il vaso (Figura 1F).</li>
	<li>Infondere successivamente nell'animale 100 μL della soluzione di destrano FITC (2000 kDa, 40 mg/mL in PBS) e 100 μL di sospensione di cellule del sangue (ematocrito al 30%) attraverso la vena safena (Figura 1G) per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio della velocità del flusso sanguigno.</li>
	<li>Osservare il flusso sanguigno in tempo reale direttamente su un monitor video 5 minuti dopo l'iniezione. Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro (W.D.) (W.D. 30,5 mm, 10x, apertura numerica 0,26) e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile (Table of Materials). Registrare il video utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione in bianco e nero ad accoppiamento di carica (Table of Materials) a 2 fotogrammi / s). Acquisisci più di 350 immagini per video per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso. NOTA: I vasi sanguigni sia del legamento a spirale che della stria vascolare possono essere visualizzati regolando la messa a fuoco ottica (video supplementare 1).</li>
</ol>4. Analisi video
<ol><li>Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato (Table of Materials) e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite.</li>
	<li>Calcolare la velocità del flusso sanguigno dai fotogrammi video acquisiti tracciando il movimento delle cellule del sangue marcate nella distanza spaziale tra le posizioni delle immagini27.<ol><li>Apri il video del flusso sanguigno nel software (Fiji [ImageJ] è stato utilizzato in questo protocollo) e imposta la scala delle immagini.</li>
		<li>Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento. Utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare la portata volumetrica (F) secondo la seguente equazione: F = V × A. (V: velocità; A: area della sezione trasversale della nave).</li>
</ol>5. Esposizione al rumore
<ol><li>Metti gli animali in gabbie di rete metallica. Esporli al rumore a banda larga a 120 dB di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per 3 ore e per altre 3 ore il giorno successivo. NOTA: Questo regime di esposizione al rumore, abitualmente utilizzato in questo laboratorio, produce una perdita permanente della sensibilità cocleare28.</li>
</ol>

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<li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l'etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l'imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria va...

La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva1. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell'orecchio interno, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'idrope dell'orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualizzazione del CoBF intravitale consentirà una migliore comprensione dei legami tra funzione uditiva e patologia vascolare cocleare.
Sebbene la complessità e la posizione della coclea all'interno dell'osso temporale precludano la visualizzazione diretta e la misurazione del CoBF, sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione del CoBF tra cui la flussimetria laser-doppler (LDF)10,11,12, la risonanza magnetica (MRI)13, la microscopia intravitale a fluorescenza (FIVM)14, la microendoscopia a fluorescenza (FME)15, l'imaging endoscopico a contrasto laser speckle (LSCI)16 , e approcci basati sull'iniezione di marcatori marcati e microsfere marcate radioattivamente nel flusso sanguigno (microangiografia ottica, OMAG)17,18,19,20. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha consentito il monitoraggio assoluto in tempo reale delle variazioni del CoBF in vivo, ad eccezione di FIVM. FIVM, in combinazione con una finestra del vaso nella parete cocleare laterale, è un approccio che è stato utilizzato e validato in cavie in diverse condizioni sperimentali da vari laboratori 14,21,22.
È stato stabilito con successo un metodo FIVM per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nella microcircolazione cocleare nel topo utilizzando isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano come mezzo di contrasto e un colorante di fluorescenza - DiO (3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato, verde) o Dil (1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato, rosso) - per premarcare le cellule del sangue, visualizzare i vasi e monitorare la velocità del flusso sanguigno. Nel presente studio, il protocollo di questo metodo è stato descritto per l'imaging e la quantificazione dei cambiamenti nel CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche (come dopo l'esposizione al rumore). Questa tecnica fornisce al ricercatore gli strumenti necessari per studiare i meccanismi alla base del CoBF correlati alla disfunzione uditiva e alla patologia nella stria vascolare, specialmente se applicata in combinazione con modelli murini transgenici prontamente disponibili.

<table><tbody><tr><td>0,9% cloruro di sodio</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0,6 mL (per 1 mL)</td></tr><tr><td>1,1&prime;-diottadil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td>20 &; M</td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocianina percloratoDio (3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocianina perclorato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>CODA Sistema di monitoraggio</td><td>Kent scientific</td><td></td><td>CODA Monitor, per il monitoraggio della pressione sanguigna e del battito cardiaco</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>DC Regolatore di temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Misura del diametro del vaso</td></tr><tr><td>FITC-destrano (2000 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 mg/mL</td></tr><tr><td>Iniezione di eparina sodica, USP MDV</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 unità USP/mL</td></tr><tr><td>Catetesia (100 mg/mL)</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0,2 mL (per 1 mL)</td></tr><tr><td>Obiettivo per microscopio</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>Modello: M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER Fotocamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Modello: C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluito per l'uso)</td><td>Lloyd</td><td>LPFL04821</td><td>0,2 mL (per 1 mL)</td></tr><tr><td>Zoom Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td>Modello: SZ61, microscopio a fluorescenza</td></tr></tbody></table>

misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l'equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell'udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L'indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all'orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell'imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l'approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.

Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale (Figura 1), l'osservazione microscopica a fluorescenza intravitale ad alta risoluzione delle cellule del sangue marcate con Dil in vasi marcati con FITC era fattibile attraverso una finestra aperta del vaso. La Figura 2A è un'immagine rappresentativa scattata sotto FIVM che mostra i capillari della parete laterale dell'apice cocleare del topo. La lumina di...

Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.

Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Il normale apporto di sangue alla coclea è di fondamentale importanza per la malattia di Meniere della coclea, in particolare per il mantenimento del potenziale cocleare interno, che è la forza trainante essenziale per la transazione delle cellule ciliate. Questa funzione della circolazione sanguigna è stata strettamente associata a diverse forme di perdita dell'udito. Una migliore comprensione del flusso sanguigno cocleare consentirà una gestione più efficace dei disturbi dell'udito derivanti dalla disfunzione del flusso sanguigno.Tuttavia, la misurazione diretta del flusso sanguigno è molto impegnativa a causa della difficoltà di valutare l'orecchio interno. Le tecniche per valutare il flusso sanguigno cocleare sono attualmente ancora in fase di sviluppo. Qui dimostriamo uno dei recenti metodi stabiliti nel nostro laboratorio aprire la finestra muscolare in alloggi con microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione per restringere il flusso sanguigno cocleare in piccole specie animali come il topo.L'applicazione di questa tecnica con modelli di massa transgenici ha il potenziale per far progredire la ricerca per svelare i legami tra la funzione uditiva e la patologia correlata al flusso sanguigno cocleare nel rischio intravascolare. Le nostre procedure devono essere condotte con cautela. Oltre all'emorragia momentanea del corpo, i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.Inizia raccogliendo circa un millimetro di sangue nell'eparina mediante puntura cardiaca. Centrifugare il sangue a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il plasma, quindi lavare il pellet delle cellule del sangue con un millilitro di PBS tre volte mediante centrifugazione a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.Etichettare le cellule del sangue con un millilitro di 20 micromolari DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule del sangue marcate con un millilitro di PBS e centrifugare tre volte a 3000 volte G per tre minuti. Risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con circa 0,9 millilitri di PBS prima dell'iniezione.Preparare strumenti chirurgici sterili e piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo. Monitorare il cattivo riflesso e il tono muscolare generale dei topi anestetizzati per verificare la profondità dell'anestesia. Posizionare l'animale sulla piastra riscaldante calda e la sua coda nel sistema di monitoraggio per il monitoraggio della pressione sanguigna e del battito cardiaco.Mantenere la temperatura rettale a 37 gradi Celsius e registrare la pressione sanguigna sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media nella condizione anestetizzata. Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e vennale al microscopio stereo lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini. Fai un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata per ridurre al minimo il movimento.Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare. Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla. Aprire la bolla ossea con un ago calibro 30 e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara dell'arteria cocleare e stapediale con il suo margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e causa superiore anteriore verso la finestra ovale.Utilizzare una piccola lama di coltello per raschiare l'osso della parete laterale all'apice della coclea del topo a circa 1,25 millimetri dall'apice fino a quando un punto sottile non si incrina. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici. Coprire il finestrino della nave con una linguetta di copertura tagliata per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave.Fare un'incisione di un centimetro lungo la vena safena destra per esporre il vaso. Infondere successivamente 100 microlitri ciascuno della soluzione FITC-Dextran e la sospensione di cellule del sangue nell'animale attraverso la vena safena per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio del flusso sanguigno. Osservare il flusso sanguigno in tempo reale su un monitor video cinque minuti dopo l'iniezione.Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile. Registra il video utilizzando una fotocamera digitale in bianco e nero ad alta risoluzione che acquisisce più di 350 immagini per video. Per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso.Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite. Apri il video del flusso sanguigno nel software e imposta la scala delle immagini. Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento.Quindi utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso. Calcolare la portata volumetrica utilizzando l'equazione fornita nel manoscritto testuale. Per creare il modello di esposizione al rumore prima della registrazione del flusso sanguigno, posizionare gli animali in gabbie di rete metallica ed esporli al rumore a banda larga a 120 decibel di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per tre ore.Poi per altre tre ore il giorno successivo. Registra il flusso sanguigno due settimane dopo l'esposizione al rumore. Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale, l'osservazione microscopica a fluorescenza ad alta risoluzione intravitale delle cellule del sangue marcate con DiL nei vasi marcati con destrano FITC è stata eseguita attraverso una finestra vasale aperta.Le cellule del sangue marcate con DiL nei vasi Stria marcati con FITC Dextran sono mostrate qui. Le cellule del sangue marcate con Dio marcate con FITC Dextran mostrano che la densità vascolare del legamento a spirale è più rada di quella della più densa Stria vascularis. IVM ad alta risoluzione mostra i modelli di flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore.Il modello disturbato della circolazione sanguigna può essere visto nei gruppi esposti al rumore. Le anomalie includevano la riduzione del diametro del vaso e l'aumento della variazione del diametro del vaso. Le velocità del flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore sono state calcolate monitorando le radici delle cellule del sangue marcate con DiO.La velocità e il volume del sangue nel gruppo esposto al rumore erano significativamente inferiori rispetto al gruppo di controllo. La creazione di successo della finestra aperta della nave richiede un alto grado di abilità chirurgica. Bisogna fare attenzione nella rimozione dell'osso della parete laterale cocleare.

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Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l'immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con 2-fotone microscopia. Questo video mostra come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

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Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

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Questo video mostra la tecnica di microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi in un modello murino. Al topo viene iniettato un polisaccaride marcato con fluoroforo per monitorare la circolazione sanguigna. Dopo l'illuminazione con una luce ad alta intensità, l'induzione fototossica di una lesione nella microvascolarizzazione dell'orecchio porta alla formazione di un trombo, che viene confermato visualizzando l'ostruzione nel flusso sanguigno.

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Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.

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Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale (Video) | JoVE Journal

Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

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