Name: Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Scopri l'impronta proteica radicale idrossile senza laser per analisi strutturali di ordine superiore. Questo metodo con dosimetria radicale inline migliora la riproducibilità e accelera lo studio dell'aggregazione e della stabilità proteica.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).

1. Installazione del tubo capillare
<ol><li>Utilizzando una pietra di scissione della silice, scindere il capillare di silice di diametro interno (ID) di 250 μm a 27 pollici. Controllare le estremità capillari per un taglio pulito e dritto.</li>
	<li>Creare due finestre di circa 15 mm di lunghezza bruciando via il rivestimento in poliimmide. Partendo dall'"estremità inferiore" si fa la prima finestra di fotolisi a 90 mm di distanza dall'"estremità inferiore" e la seconda finestra del dosimetro a 225 mm di distanza dall'"estremità inferiore". NOTA: Una volta bruciato il rivestimento, il capillare è molto fragile.</li>
	<li>Svitare il dado e il ferrule alla porta 5 e inserire l'"estremità inferiore" del capillare appena oltre l'estremità conica del ferrule(Figura 1A).</li>
	<li>Sul modulo di fotolisi, rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi tirandolo direttamente fuori e quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente che terrà il capillare in posizione. ATTENZIONE: All'interno del cappuccio della cella di fotolisi c'è uno specchio curvo, non permettere a nulla di toccare lo specchio.</li>
	<li>Sul modulo dosimetro aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra. Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione.</li>
	<li>Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella di fotolisi. Centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenendo il capillare in posizione con una mano, aggiungere la maschera magnetica per tenere il capillare in posizione. Riposizionare il cappuccio della fotolisi.</li>
	<li>Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella del dosimetro. Centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della base cellulare del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione. Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso.</li>
	<li>Inserire il capillare attraverso il dado zigrinato in cima al sollevatore capillare del raccoglitore di prodotti(Figura 1B). Estendere il capillare appena sopra il fondo del flaconcino. NOTA: È importante che il capillare raggiunga il fondo del flaconcino per assicurarsi che il capillare sia immerso nella soluzione di tempra durante l'esecuzione di un esperimento.</li>
</ol>2. Installazione di un ciclo di iniezione
<ol><li>Utilizzare tubi in teflon con un diametro esterno di 1/16" e un diametro interno di 0,015" (381 μm). Seguire l'equazione 1 per calcolare la lunghezza dei tubi necessari per il volume desiderato utilizzando l'equazione 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> Dove L è la lunghezza del tubo in millimetri, V è il volume desiderato nei microlitri e d è il diametro interno del tubo in millimetri. Per un volume di iniezione di 25 μL e un diametro interno di 381 μm, la lunghezza del tubo deve essere di circa 219,3 mm. NOTA: Per volumi inferiori a 20 μL, utilizzare tubi PTFE con diametro interno di 0,01".</li>
	<li>Tagliare i tubi in teflon alla lunghezza necessaria utilizzando una fresa a tubo. Controllare le estremità del tubo per un taglio pulito e dritto.</li>
	<li>Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il ferrule e il dado in posizione e inserire il tubo nella porta 3 della valvola di iniezione fino a quando non si escola nella valvola. Tenere saldamente il tubo e stringere il dito del dado stretto. Utilizzando una chiave inglese, stringere ulteriormente il dado 1/4 di giro. Rimuovere e ispezionare l'assieme. NOTA: Se il ferrule non è fissato in posizione, reinstallare e stringere ulteriormente 1/8. Ripetere con l'altra estremità del ciclo.</li>
	<li>Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta 3 e l'altra estremità alla porta 6 (Figura 1C). Una volta in posizione stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi 1/4 girare oltre il dito stretto con una chiave inglese.</li>
</ol>3. Inizializzare il sistema di fotolisi
<ol><li>Accendere i moduli di fotolisi nel seguente ordine: (1) Modulo fluidics (2) Modulo di fotolisi (3) Modulo dosimetrico (4) Raccoglitore prodotti, e infine (5) il computer di sistema e avviare il software di controllo NOTA: Lasciare che il modulo dosimetro almeno mezz'ora si il riscaldamento da un avvio a freddo.</li>
	<li>Immergere completamente i tubi dalla posizione "Valve" sulla pompa della siringa (Figura 1D) in 10 ml di tampone. Posizionare i tubi dalla posizione "Rifiuti"(figura 1D)e i tubi della porta 2 sulla porta della siringa (Figura 1C) in un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti. NOTA: Usa il buffer in cui la tua proteina verrà sospesa. Un buffer consigliato è 10 mM NaPO4.</li>
	<li>Sulla giostra Del Collettore di Prodotto, posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 ml nella posizione contrassegnata con H e 6.</li>
	<li>Se si utilizza un capillare ID 250 μm, impostare la portata di carico su 500 μL/min, la portata di elaborazione a 7,5 μL/min e la portata di scarto a 500 μL/min.</li>
	<li>Calcola il ritardo del flash, il tempo del prodotto e il tempo di perdita per utilizzare la modalità semiautomatica usando l'equazione 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Dove t è il tempo in minuti, s è la distanza capillare in millimetri, d è il diametro interno del capillare in millimetri, e f è la portata in μL/min.<ol>
<li>Per il ritardo del flash, la distanza è dall'"estremità inferiore" del capillare alla prima finestra, che dovrebbe essere di circa 90 mm. Utilizzando un capillare ID 250 μm e una portata di elaborazione di 7,5 μL/min, il campione arriverà alla finestra di fotolisi in circa 35 secondi. Consentire due flash a 1 Hz prima dell'arrivo dei campioni, quindi impostare il ritardo del flash su 33 secondi.</li>
		<li>Per il tempo del prodotto, inserire la quantità di tempo che la soluzione iniettata richiederà per fluire dalla valvola di iniezione alla fine del capillare. Per un capillare ID lungo 27" da 250 μm, impostare il tempo di prodotto su 4,5 minuti.</li>
		<li>Per il tempo di perdita, immettere il tempo necessario per raccogliere il volume totale della soluzione iniettata. In questo momento, il collettore di prodotti si sposterà dalla posizione del prodotto al flaconcino di scarto. Per un volume di iniezione di 25 μL e una portata di 7,5 μL/min, impostare il tempo di perdita su 7,8 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 μL di acqua di grado HPLC nella porta di iniezione con la valvola di iniezione impostata sulla posizione di carico.</li>
	<li>Ruotare manualmente la valvola di iniezione fino a "posizione di iniezione" per scaricare il resto del sistema. Selezionare Processo (Out) sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua. Durante il flusso, sollevare il sollevatore capillare del collettore di prodotto selezionando Su sotto il raccoglitore di prodotti in modo da poter vedere la fine del capillare. Scorrere l'acqua attraverso il capillare fino a regolare una goccia. NOTA: Se una goccia non si forma, controllare la presenza di perdite nella valvola dell'iniettore. Se c'è una perdita, allentare il dado, risediare il capillare e il retighten.</li>
</ol>4. Determinare l'▪o rendimento OH per testare gli effetti di scavenging radicale dal buffer.
<ol><li>Nel software di controllo avviare il flusso selezionando Processo (Out). Nella scheda impostazioni impostare la tensione flash su 0 V. Nella scheda Controllo manuale della sezione dati del dosimetro selezionare Avvia dati + AutoZero.</li>
	<li>Selezionare la posizione per il flaconcino del prodotto (H) e il flaconcino di scarto (6).</li>
	<li>Selezionare Pronto, abbassare manualmente la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di 1 mM di Adenine con 100 mM H2O2 nella porta di iniezione. Una volta iniettato, ruotare manualmente la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione. NOTA: Questo attiva automaticamente il sistema per iniziare il flusso, accendere la sorgente plasmatica e acquisire i dati di dosimetria.</li>
	<li>Aumentare la tensione navigando verso la scheda impostazioni e modificando la tensione del flash. Ripetere i passaggi 4.2 e 4.3 utilizzando 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire la lettura dell'assorbanza di adenina ad ogni tensione in triplicati.</li>
	<li>Selezionare la scheda calcoli per determinare l'assorbanza media di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio. Ripetere l'evento per tutti i dati acquisiti. NOTA: Le bolle possono formarsi causando un picco nella lettura del dosimetro. Quando si selezionano i dati per determinare l'assorbanza media, omettere le aree con bolle.</li>
	<li>Copiare e incollare i dati in Excel per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione, determinando così l'effettiva ▪di OH.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.6 se vengono utilizzate più condizioni del campione (buffer/additivi diversi) per normalizzare l'efficace ▪OH per ogni condizione.</li>
</ol>5. Modifica delle proteine per rilevare i cambiamenti nella struttura di ordine superiore.
<ol><li>Mescolare 4 mM di adenina con 20 μM di proteine in un rapporto uno a uno per creare una soluzione contenente 2 mM di adenina e 10 μM di proteine.</li>
	<li>Fare la soluzione di tempra utilizzando 0,3 mg/mL di catalasi per abbattere il perossido di idrogeno in eccesso e l'ammide metoionina da 35 mM per spegnere eventuali radicali rimanenti. Aliquota 25 μL di soluzione di tempra in un microtubo da 200 μL in modo che un volume uguale di tempra e il prodotto etichettato sia miscelato.</li>
	<li>Diluire H2Oda 2 a 200 mM e tenere sul ghiaccio.</li>
	<li>Nel software di controllo nella scheda impostazioni, avviare la tensione flash a 0 V per determinare eventuali ossidazioni di fondo.</li>
	<li>Nella scheda controllo manuale selezionare Avvia dati + AutoZero, seguito da Processo (Out),quindi Pronto, e infine abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.</li>
	<li>Posizionare una soluzione di tempra nella posizione 1 sul carosello di raccolta del prodotto. Nel software di controllo del sistema cambiare il flaconcino del prodotto su 1.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 μL della miscela di adenina e proteine con 12,5 μL di H2O2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM di Adenina, 5 μM di proteina e 100 mM H2O2. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare, girare rapidamente verso il basso e iniettare 25 μL utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione.</li>
	<li>Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione.</li>
	<li>Ripetere l'acquisizione con 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire ogni misurazione della tensione in triplice copia.</li>
	<li>Calcolare l'assorbanza media descritta nel passaggio 4.5. Copiare e incollare tutti i dati in Excel.</li>
</ol>6. Arrestare il sistema
<ol><li>Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di acqua HPLC cinque volte.</li>
	<li>Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC.</li>
	<li>Interrompere il flusso, chiudere il software di controllo del sistema e spegnere i moduli a partire dal raccoglitore di prodotti, modulo dosimetro, modulo di fotolisi, quindi infine il modulo fluidico.</li>
</ol>7. Preparazione del campione e cromatografia liquida-spettrometria di massa
<ol><li>Denaturare la proteina incubando campioni a 80 °C per 20 min in presenza di Tris da 50 mM e 1 mM CaCl2. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1:20 tripina alle proteine. Digerire la proteina durante la notte a 37 °C con miscelazione del campione. La mattina successiva, terminare la digestione della tripina riscaldando i campioni a 95 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Rilevare peptidi utilizzando un sistema LC-MS/MS ad alta risoluzione collegato a un sistema UPLC.</li>
	<li>Caricare prima il campione sulla colonna trappola (ID X 5 mm 5 mm 100 Å pore, dimensione delle particelle di 5 μm) e lavare a 5,0 μL/mL per 3 minuti con acqua contenente il 2% di solvente B (acetonitrile e 0,1% di acido formico).</li>
	<li>Separare i peptidi su una nanocolonna C18 (0,75 mm x 150 mm, dimensione delle particelle di 2 μm, dimensione del poro 100 Å) ad una portata di 300 nL/min con un gradiente tra il solvente A (acqua contenente lo 0,1% di acido formico) e il solvente B. Il gradiente per l'eluizione peptidica consiste in un aumento lineare dal 2 al 35% B su 22 min, rampato al 95% B su 5 min e tenuto per 3 minuti per lavare la colonna, per poi tornare al 2% B su 3 min e tenuto per 9 minuti per ri-equilibrare la colonna.</li>
	<li>Acquisire i dati in modalità ioni positivi. Impostare la tensione di spruzzatura su 2400 V e la temperatura del tubo di trasferimento ionino a 300 °C.</li>
	<li>Acquisire le scansioni MS complete da 250-2000 m/z seguite da otto successive scansioni MS/MS dipendenti dai dati sui primi otto ioni peptidici più abbondanti. Usa la dissociazione indotta da collisione al 35% di energia normalizzata per frammentare i peptidi.</li>
	<li>Identificare tutti i peptidi non modificati rilevati dall'analisi MS/MS utilizzando un software di analisi proteica disponibile rispetto al file FASTA necessario contenente la sequenza proteica e l'enzima proteolitico pertinente.</li>
	<li>Ricercare e quantificare peptidi modificati utilizzando un software di elaborazione dati HRPF. L'estensione di ossidazione per ogni peptide identificato è calcolata dividendo l'area di picco cromatografica sommata di un peptide modificato per l'area di picco cromatografica totale di quel peptide modificata e non modificata usando l'equazione 3. P = [I(singolarmente ossidato) X 1 + I (doppiamente ossidato) X 2 + I(tripli ossidato) X 3 + .../[Iunoxidizzato + I(singolarmente ossidato) + I(doppiamente ossidato) + I(tripli ossidato)...] dove P denota il numero medio di eventi di ossidazione per molecola peptidica, e I rappresenta l'area di picco del peptide non idrossizzato(Iunoxidizzato)e il peptide con n eventi di ossidazione.</li>
</ol>8. Per uno studio differenziale, ripetere i passaggi 5-7 sulla seconda condizione.
NOTA: Per confermare la riproducibilità, si raccomandano due repliche biologiche oltre a triplicati tecnici per ogni condizione.

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</ol>

E.E.C., J.S.S. e S.R.W. rivelano un significativo interesse finanziario in GenNext Technologies, Inc., una società in fase iniziale che cerca di commercializzare tecnologie per l'analisi della struttura proteica di ordine superiore. I dati rappresentativi forniti sono stati esaminati da S.K.M., che non ha alcun conflitto di interessi finanziari.

Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la struttura...

La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell'HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l'industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina HOS svolge nella sicurezza e nell'efficacia della bioterapia e hanno stabilito la necessità di nuove e migliorate analisi HOS4.
L'ingombro di proteine radicali idrossili (HRPF) è una tecnica promettente per tenere traccia del cambiamento nella proteina HOS. HRPF comporta l'etichettatura irreversibile dell'esterno di una proteina con ▪OH seguita da analisi di spettrometria di massa (MS) per identificare la superficie accessibile al solventedella proteina 5,6,7. HRPF è stato utilizzato con successo per rilevare difetti nella proteina HOS e la suafunzione 8,9, caratterizzano l'HOS degli anticorpi monoclonali (mAb)10,11,12,13,determinare il Kd legante di un ligando14,e molto altro15,16,17,18,19. Un metodo comune per generare il ▪OH per HRPF è l'ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP), che impiega laser UV veloci ad alta energia per produrre ▪ OH dallafotolisi di H2O2. Per la maggior parte, FPOP utilizza costosi laser ad eccimeri che impiegano gas pericoloso (KrF) che richiede garanzie sostanziali per evitare lesioni respiratorie eoculari 20. Per evitare rischi di inalazione, altri hanno utilizzato laser in alluminio al neodimio yttrium alluminio quadruplicati a frequenza (Nd:YAG)21, che eliminano l'uso di gas tossici ma sono ancora costosi, richiedono una significativa competenza operativa e richiedono ampi controlli della luce vagante per proteggere gli utenti dalle lesioni agli occhi.
Sebbene sia possibile ottenere ampie informazioni utilizzando HRPF, non è stata soddisfatta un'ampia adozione in biofarmacia. Due ostacoli per la limitata adozione dell'HRPF comprendono: 1) l'uso di laser pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezzasostanziali 20; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studicomparativi 22. Per soppiantare l'uso del laser, è stata sviluppata un'unità di fotolisi flash al plasma ad alta velocità e ad alta energia per eseguire in modo sicuro FPOP in modo semplice. Per migliorare l'irriducibilità degli esperimenti HRPF, viene implementata la dosimetria radicale in tempo reale.
La pratica dell'HRPF è stata limitata dall'irriducibilità attribuita allo scavenging di fondo ▪OH22. Mentre ▪OH sono eccellenti sonde di topografia proteica, reagiscono anche con molti costituenti trovati nei preparati, rendendo necessario misurare l'effettiva concentrazione di radicale disponibile per ossidare una proteina bersaglio. Variazioni nella preparazione del tampone, concentrazione di perossido di idrogeno, proprietà del ligando o fotolisi possono causare differenze di ossidazione tra il controllo e gruppi sperimentali che creano ambiguità negli studi differenziali HOS. L'aggiunta della dosimetria radicale in tempo reale consente la regolazione dell'effetto ▪carico OH e quindi aumenta la confidenza e la riproducibilità durante un esperimento HRPF. L'uso della dosimetria radicale nell'FPOP è stato descritto altrove23,24,25, ed è ulteriormente discusso in dettaglio in una recente pubblicazione26. Qui descriviamo l'uso di un nuovo sistema di fotolisi flash e dosimetria in tempo reale per etichettare l'apo-mioglobina equina (aMb), confrontando i livelli di ossidazione peptidica in un esperimento FPOP con quello ottenuto quando si utilizza un laser ad eccimeri.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>qualsiasi marca è sufficiente</td></tr><tr><td>50 &micro; L SGE Siringhe a tenuta di gas</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolonna (0,75 mm X 150 mm, 2 &; m)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile con 0,1% di acido formico (v/v), grado LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomioglobina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Tergicristalli per compiti delicati</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>qualsiasi 30% di perossido di idrogeno è sufficiente</td></tr><tr><td>Metionina ammide</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Spettrometro di massa tribrido</td><td>Lumos Thermo Scientific</td><td>Spettrometro di massa tribrido Orbitrap Fusion Lumos</td><td>altri strumenti ad alta risoluzione (ad es. Q exactive, Orbitrap o Orbitrap Fusion) possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Proteasi, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1/32"</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>qualsiasi tagliatubi capillare è sufficiente</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water con 0,1% di acido formico (v/v), LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Water, LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

L'impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l'adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l'uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.

La sorgente plasmatica ad alta pressione accoppiata con la dosimetria in tempo reale consente un migliore controllo della resa di ▪OH per osservare i cambiamenti nella struttura proteica di ordine superiore in modo più accurato. L'aggiunta di adenina consente un dosimetro radicale efficace in tempo reale. Al momento dell'ossidazione, l'adenina perde assorbanza UV a 265 nm (Figura 2A). Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina è direttamente correlato alla concentrazione di radic...

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

L'impronta proteica dei radicali idrossilici senza laser rende molto più semplice identificare i siti di interazione proteica e le regioni di cambiamento confermazionale, accelerando la ricerca negli studi di aggregazione, struttura e stabilità delle proteine. Con la dosimetria radicale in linea, gli utenti possono regolare il carico efficace di radicali idrossilici in tempo reale e, con la dosimetria radicale in tempo reale, è possibile risparmiare tempo sperimentale e campione prezioso migliorando al contempo la riproducibilità dell'etichettatura. Per iniziare, scindere un capillare di silice di diametro interno di 250 micrometri a 27 pollici con una pietra di taglio della silice, controllando le estremità del capillare per un taglio pulito e dritto.Creare due finestre di circa 15 millimetri di lunghezza. Dall'estremità inferiore del capillare, bruciare via il rivestimento in poliimmide 90 millimetri fino a creare la finestra di fotolisi e 225 millimetri per la finestra del dosimetro. Inserire l'estremità inferiore del capillare appena oltre l'estremità conica di un dado e di un ferrule.Aggiungere il capillare alla porta cinque, stringendo appena oltre il dito stretto con una chiave inglese. Rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi del modulo di fotolisi tirandolo direttamente fuori, quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente, che terrà il capillare in posizione. Aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra.Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione. Quindi posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella di fotolisi e centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenere il capillare in posizione e aggiungere la maschera magnetica.Riposizionare il cappuccio della fotolisi. Posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella del dosimetro e centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della cella del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione.Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso. Infine, inserire il capillare attraverso la manopola zigrinata in cima al sollevatore capillare del collettore del prodotto, estendendo il capillare appena sopra il fondo del flaconcino. Tagliare la lunghezza desiderata dei tubi in teflon utilizzando una fresa e controllare le estremità per un taglio dritto pulito.Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il dado e il ferrule in posizione mentre si inserisce il tubo nella porta sei della valvola di iniezione fino a quando non si es verso l'alto. Stringere il dado con una chiave inglese, quindi confermare che il dado e il ferrule sono saldamente in posizione.Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta tre e l'altra estremità alla porta sei. Una volta in posizione, stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi un quarto girare oltre il dito stretto con una chiave inglese. Accendere il sistema HRPF senza laser avviando il modulo fluidico, seguito dal modulo di fotolisi, dal modulo dosimetro, dal raccoglitore di prodotti e dal computer di sistema.Avviare il software di sistema. Immergere completamente i tubi in 10 millilitri di tampone dalla posizione della valvola sulla pompa della siringa. Dirigere i tubi dalla posizione dei rifiuti e i tubi dalla porta due sulla porta della siringa verso un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti.Posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri nella posizione contrassegnata con HN6 sul carosello del collettore di prodotto. Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 microlitri di acqua di grado HPLC con la valvola impostata sulla posizione di carico. Ruotare manualmente la valvola di iniezione per sciacquare il resto del sistema.Selezionare Processo sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua fino a quando non si forma una goccia. Creare una soluzione contenente due adenine millimolare e 10 proteine micromolari. Quindi fare una soluzione di tempra usando 0,3 milligrammi per millilitro catalasi e 35 millimolare ammide di metina.Aliquot 25 microlitri di soluzione di tempra in un microtubo da 200 microlitri. Diluire il perossido di idrogeno a 200 millimolare, mantenendolo sul ghiaccio. Avviare la tensione flash a zero volt sul software di controllo.Questo controllo a volt zero determinerà qualsiasi ossidazione di fondo sulla proteina di interesse. Selezionare Avvia controllo automatico dati, seguito da Processo e quindi Pronto. Infine, abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.Posizionare la soluzione di tempra in posizione uno sul carosello del collettore di prodotto, quindi cambiare il flaconcino del prodotto in uno sul software di controllo del sistema. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 microlitri della miscela di adenina e proteine con 12,5 microlitri di perossido di idrogeno. Pipettare la miscela su e giù per mescolare, quindi ruotarla rapidamente verso il basso.Iniettare 25 microlitri di questa soluzione utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione. Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione. Alzare la tensione flash a 750 volt sul software di controllo e ripetere i passaggi di etichettatura.Quindi registrare l'assorbanza di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio.Ripeti questo per tutti i dati acquisiti. Copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione. Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 microlitri di acqua HPLC cinque volte.Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC. Una volta lavato, arrestare il flusso, uscire dal software di controllo del sistema e spegnere i moduli, a partire dal raccoglitore di prodotti, dal modulo dosimetro, dal modulo di fotolisi e infine dal modulo fluidico. Dopo l'ossidazione, l'adenina utilizzata per la dosimetria diminuisce nell'assorbanza UV a 265 nanometri.Il buffer 2 contiene uno spazzino radicale, che riduce la variazione dell'assorbanza dell'adenina rispetto al Buffer 1. L'apomioglobina è stata modificata in presenza di perossido di idrogeno e adenina a quattro crescenti tensioni della lampada al plasma. Sono stati rilevati sei peptidi, con un aumento lineare dell'ossidazione rispetto al cambiamento dell'assorbanza dell'adenina a 265 nanometri.Questi sei peptidi ossidati sono etichettati su una struttura cristallina di mioglobina. L'estensione dell'ossidazione rilevata dalla lampada al plasma ad alta pressione è molto più alta del metodo basato su laser. Questo aumento deriva dall'ampio spettro di emissione UV della lampada al plasma ad alta pressione.Producendo un ampio spettro UV, la lampada al plasma ad alta pressione si sovrappone meglio al dominio di assorbanza del perossido di idrogeno, risultando in una produzione più efficiente di radicali idrossilici attraverso la fotolisi del perossido di idrogeno, rispetto al laser Kr F Excimer e al laser Nd YAG. La lampada al plasma ad alta pressione aumenta significativamente la produzione di radicali idrossilici oltre a quanto si osserva tipicamente utilizzando un laser Kr F Excimer. L'uso di perossido di 100 millimolare può causare alti livelli di ossidazione dello sfondo.Se il sistema proteico è suscettibile all'ossidazione indotta dal perossido, ridurre la concentrazione fino a 10 millimolare. L'etichetta irreversibile di HRPF consente la gestione a valle del campione, comprese le lunghe digestione della proteasi, è possibile aggiungere tag di massa tandem per il multiplexing ed eseguire la cromatografia 2D, il tutto migliorando il rilevamento peptidico e le informazioni strutturali coordinate.

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Questo protocollo descrive come quantificare il Mg (II)-dipendente formazione della struttura terziaria dell'RNA con due metodi di footprinting radicali idrossili.

Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; Footprinting radicale ossidrile

Misura della massa accurata rappresenta un passo importante nel corso dell'inchiesta di proteine. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa (MS) può essere utilizzato per tale determinazione e il suo vantaggio chiave è la tolleranza di sali, detergenti e contaminanti. Qui illustriamo un approccio accessibili per l'analisi di proteine ​​più grandi di 100 kDa tramite MALDI-MS.

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

L'architettura dei complessi della proteina è essenziale per la loro funzione. Combinando varie tecniche di spettrometrihe di massa ha dimostrato potente per studiare il loro assemblaggio. Forniamo i protocolli per reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa e mostrare come queste tecniche complementari consentono a delucidare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina.

Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

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Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

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L'ossidazione fotochimica veloce in vivo delle proteine (IV-FPOP) è una tecnica di impronta proteica radicale idrossile che consente di mappare la struttura delle proteine nel loro ambiente nativo. Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'impostazione del sistema di flusso microfluidico IV-FPOP.

Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Qui, caratterizzamo la struttura delle proteine e i siti di interazione nelle cellule viventi utilizzando una tecnica di impronta delle proteine definita ossidazione fotochimica veloce in cell delle proteine (IC-FPOP).

Caratterizzare le proteine cellulari con l'ossidazione fotochimica veloce all'incell delle proteine

L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine è una tecnica emergente per la caratterizzazione strutturale delle proteine. Diversi additivi solventi e ligand hanno varie proprietà di scavenging radicale idrossile. Per confrontare la struttura della proteina in diverse condizioni, è necessaria una compensazione in tempo reale dei radicali idrossili generati nella reazione per normalizzare le condizioni di reazione.

Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia proteica

Vengono descritte le procedure sperimentali per l'esecuzione di etichette covalenti a base di dietilpirrocarbonato con rilevamento spettrometrico di massa. Il dietilpirrocarbonato viene semplicemente miscelato con il complesso proteico o proteico di interesse, portando alla modifica di residui di amminoacidi accessibili al solvente. I residui modificati possono essere identificati dopo la digestione proteolitica e l'analisi della cromatografia liquida/spettrometria di massa.

Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Una nuova piattaforma statica viene utilizzata per caratterizzare la struttura proteica e i siti di interazione nell'ambiente delle cellule native utilizzando una tecnica di impronta proteica chiamata ossidazione fotochimica veloce in cella delle proteine (IC-FPOP).

Incubatore di piattaforme con stadio XY mobile: una nuova piattaforma per l'implementazione dell'ossidazione fotochimica veloce in cella delle proteine

Scopri l'impronta proteica radicale idrossile senza laser per analisi strutturali di ordine superiore. Questo metodo con dosimetria radicale inline migliora la riproducibilità e accelera lo studio dell'aggregazione e della stabilità proteica.

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

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