Studio della dinamica delle proteine tramite spettroscopia eco-spin neutronica

Il seguente protocollo presenta come impostare un esperimento Neutron Spin Echo per misurare la funzione di scattering intermedio e studiare la dinamica delle proteine in soluzione. Il principale vantaggio della spettroscopia eco-spin neutronica è la sua capacità di osservare il riarrangiamento di domini e sottodomini proteici sulla scala temporale da pico a nanosecondi, che è la gamma di slow motion nelle proteine nel loro ambiente quasi naturale e nella soluzione proteica affollata. Neutron Spin Echo è anche sensibile alla configurazione isotopica, che consente studi molto specifici e mirati utilizzando la corrispondenza del contrasto.

Le intuizioni sulla dinamica del dominio proteico sono una parte importante della ricerca biofisica nel difficile compito in corso di trasmettere i movimenti del dominio delle proteine con la loro funzionalità biologica. Il protocollo qui presentato può essere generalmente applicato a qualsiasi misurazione neutron spin echo eseguita presso lo spettrometro SNS-NSE, indipendentemente dalla scelta dei campioni, se si rimane nel regno dei materiali di materia soffice. Per impostare l'esperimento iniziare selezionando lo spessore del carico del campione cellulare, in base alla concentrazione del campione proteico, alla temperatura necessaria per la misurazione e alla quantità di soluzione disponibile.

Pulire la cella con detersivo per piatti privo di fosfati, acqua deionizzata e dietanolo al 70%. Asciugare la cella nel forno a convezione. Caricare quattro millilitri di soluzione proteica nella cellula e chiudere con tappi.

Utilizzare film di cera o qualsiasi sigillante per sigillare le cellule del campione. Caricare quattro millilitri di tampone per dialisi in un contenitore identico al campione proteico e al sigillo. Trasportare i campioni alla linea del fascio.

Chiudere l'otturatore ed entrare nell'area della grotta del recinto dello spettrometro. Montare la cella del campione sul portacampioni in alluminio stringendo le viti e le piastre di tenuta. Montare il campione di grafite e il campione di polvere di ossido di alluminio caricati in un contenitore identico al campione proteico.

Posizionare lo stesso supporto facendolo scorrere delicatamente nella lattina del sistema di forzatura della temperatura. Chiudere il coperchio del sistema di forzatura della temperatura e impostare la temperatura sul valore desiderato accedendo allo schermo interattivo del sistema di forzatura della temperatura. Montare la telecamera a neutroni per l'allineamento dei campioni al fascio.

Per raccogliere i dati della spettroscopia neutron spin, allineare il campione nel fascio di neutroni utilizzando la telecamera a neutroni e le quattro aperture di campionamento indipendenti. Aprire la sorgente di neutroni spallazione, il software di raccolta dati per spettroscopia neutronica Neutron Spin Echo e raccogliere statistiche sui campioni eseguendo scansioni di defrazione per gli angoli di diffusione e la lunghezza d'onda desiderati. Impostare i parametri di misura in base alle statistiche raccolte per ciascun campione modificando le macro di misura fornite dall'Assisting Instrument Scientist.

Avviare la scansione digitando il nome del protocollo nel prompt dei comandi e acquisendo echi per l'esempio. Accedi al cluster Neutron Sciences Remote Analysis con le credenziali utente ORNL e premi il pulsante della sessione di avvio. Nella directory utente, aprire una finestra del terminale e digitare il comando di configurazione del software.

Quindi, digitare il comando ambiente. Creare una cartella per la riduzione dei dati nella home directory e copiare gli script e le macro forniti dalla directory condivisa. Modificare, rinominare e salvare la macro di riduzione fornita di conseguenza.

Digitare drspine" al prompt dei comandi e premere Invio per avviare l'ambiente di riduzione del software. Digitare il nome della macro di riduzione nel suggeritore di comandi all'interno dell'ambiente software e premere Invio. Modificare lo script Python fornito da Assisting Instrument Scientist con i nomi dei dati del file ridotti.

Modificare la funzione per adattarla alla libreria fornita. Digitare il nome dello script modificato nel prompt dei comandi e premere INVIO per leggere, adattare e tracciare dati NSE ridotti. La funzione di scattering intermedio misurata da NSE per le proteine IgG e MBP mostra una chiara deviazione da un semplice processo di rilassamento simile alla diffusione sulla breve scala temporale di quattro anni, indicando l'accessibilità delle dinamiche interne delle proteine da parte di NSE e la necessità di un modello più complesso per descrivere i processi dinamici osservati.

I risultati dei calcoli della funzione di scattering intermedia adattati dalla modellazione atomica di entrambe le proteine utilizzando modelli sviluppati da erano in eccellente accordo con i dati sperimentali NSE. I risultati hanno dimostrato che le dinamiche più lente osservate a tempi più lunghi possono essere attribuite ai processi complessivi di diffusione traslazionale e rotazionale, mentre le dinamiche osservate alle scale temporali brevi possono essere attribuite alla dinamica dei domini proteici. Una cosa importante da ricordare è la necessità di campioni ben preparati e puliti per le misurazioni NSE.

Un buon campione per uno Spin Echo ha un rapporto di capovolgimento superiore a tre, che è il rapporto tra scattering coerente e incoerente del campione. Anche durante la preparazione del campione e il caricamento del campione nelle cellule NSE, la soluzione del campione deve essere mantenuta sicura e priva di qualsiasi contaminazione incrociata chimica o biologica. Per motivi di sicurezza, l'ingresso nell'involucro dello spettrometro deve essere tentato solo dopo la chiusura dell'otturatore e un ulteriore tempo di mezz'ora è stato concesso per il raffreddamento delle radiazioni dell'involucro.

Lo scattering neutronico a piccolo angolo è raccomandato per valutare la forma e la struttura delle proteine in una soluzione concentrata. Può essere fatto prima o in parallelo con l'esperimento NSE. Metodi aggiuntivi come la diffusione dinamica della luce e le misurazioni della viscosità forniscono informazioni sulla diffusione traslazionale e sull'interazione idrodinamica all'interno della soluzione proteica concentrata e sono anche raccomandati.