Name: Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Scopri un modello di cocultura in vitro per valutare la rigenerazione assonale nei neuroni ganglionali retinici di ratto adulti utilizzando la glia ensheathing olfattiva. Questo metodo quantitativo supporta lo studio di potenziali terapie cellulari per lesioni del sistema nervoso.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto SAF2017-82736-C2-1-R dal Ministerio de Ciencia e Innovación al MTM-F e dalla Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.

NOTA: La sperimentazione animale è stata approvata dai comitati nazionali e istituzionali di bioetica.
1. cultura ihOEG (Ts12 e Ts14)
NOTA: Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza per la coltura tissutale.
<ol><li>Preparare un supporto di coltura OEG ME10 da 50 mL come previsto nella tabella 1.</li>
	<li>Preparare 5 ml di DMEM/F12-FBS, come previsto nella tabella 1, in un tubo conico da 15 ml.</li>
	<li>Riscaldare entrambi i supporti a 37 °C in un bagno d'acqua pulita, per 15 minuti.</li>
	<li>Scongelare le fiale delle cellule Ts12 e Ts14 a 37 °C in un bagno d'acqua pulita.</li>
	<li>Resuspend e aggiungere celle al supporto di coltura DMEM/F12-FBS preparato nel passaggio 2.</li>
	<li>Centrifuga per 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Aspira al supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di mezzo ME10 e rimosogliere il pellet.</li>
	<li>Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 3 mL di ME10 e aggiungere la sospensione cellulare, dropwise.</li>
	<li>Spostarsi per distribuire le celle in modo uniforme sulla piastra.</li>
	<li>Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO2. NOTA: Dopo aver raggiunto la confluenza, deve essere fatto almeno un altro passaggio per ottimizzare le cellule per la cocoltura. È necessaria una confluenza del 90% prima di seminarli sulle copertine per la cocoltura. Un p-60 confluente ha un numero di cella medio di 7 x 105 per Ts14 e 2,5 x 106 per le linee cellulari Ts12. Le linee cellulari Ts12 e Ts14 devono essere passaggio ogni 2-3 giorni.</li>
</ol>2. Preparazione di ihOEG (Ts12 e Ts14) per il saggio
NOTA: Questo passaggio deve essere fatto 24 ore prima della dissezione rgn e della cocoltura.
<ol><li>Trattare 12 mm Ø coprelips con 10 μg/mL poli-L-lisina (PLL) per 1 h. NOTA: Le coverlips possono essere lasciate durante la notte in soluzione PLL.</li>
	<li>Lavare i copripelli con 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS), tre volte.</li>
	<li>Staccare le cellule Ts12 e Ts14 ihOEG dal piatto di coltura cellulare p60.<ol>
<li>Aggiungere 4 ml di mezzo di coltura DMEM/F12-FBS(tabella 1)a un tubo conico da 15 ml. Riscaldare a 37 °C in un bagno d'acqua pulito.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dalle piastre e lavare le celle con 1 mL di 1x PBS-EDTA, una volta.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tripside-EDTA alle cellule OEG e incubare per 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
</li>
		<li>Raccogliere le celle con una pipetta p1000 e trasferirle su un supporto preparato nel passaggio 3.1.</li>
		<li>Centrifuga per 5 min a 200 x g.</li>
		<li>Aspira al supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di mezzo ME10 e rimospend il pellet.</li>
		<li>Contare il numero di cellulare in un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semina 80.000 cellule Ts14 o 100.000 cellule Ts12/pozzo sui copripasci in piastre da 24 pozzi in 500 μL di mezzo ME10.</li>
	<li>Cellule di coltura a 37 °C nel 5% di CO2, per 24 h.</li>
</ol>3. Dissezione del tessuto retinale
NOTA: i ratti Wistar maschi di 2 mesi sono usati come fonte RGN. Due retine (un topo) per 20 pozzi di un piatto cellulare da 24 po '. Materiale chirurgico autoclave prima dell'uso. Il kit di dissociazione papaina viene acquistato commercialmente(Tavolo dei Materiali). Seguire le istruzioni del provider per la ricostituzione. Ricostituire L,L-2-ammino-5-acido fosfonovalerico (APV) in 5 mM e preparare le aliquote.
<ol><li>Il giorno del saggio, preparare i seguenti media.<ol>
<li>Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con 5 mL di EBSS freddo (fiala 1 del kit di dissociazione della papaina).</li>
		<li>Preparare un piatto di coltura cellulare p60 con fiala ricostituita 2 (papaina) del kit di dissociazione della papaina più 50 μL di APV.  Aggiungere quindi 250 μL di flaconcino ricostituito 3 (DNasi più 5 μL di APV).</li>
		<li>In un mix di tubi sterili 2,7 ml di flaconcino 1 con 300 μL di flaconcino 4 (inibitore della proteasi albumina-ovomucoide). Aggiungere 150 μL di flaconcino 3 (DNasi) più 30 μL di APV.</li>
		<li>Preparare 20 mL di mezzo Neurobasal-B27 (NB-B27) come previsto nella tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrificare un topo per asfissia con CO2.</li>
	<li>Rimuovere la testa per decapitazione con ghigliottina; posizionarlo in una piastra di Petri da 100 mm e spruzzare la testa con etanolo al 70% prima di posizionare in una cappa di flusso laminare.</li>
	<li>Tagliare i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.</li>
	<li>Afferrare il nervo ottico con pinze per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter fare un'incisione sull'occhio con un bisturi.</li>
	<li>Rimuovere la lente e l'umorismo vitreo ed estrarre la retina (tessuto arancione), mentre gli strati rimanenti dell'occhio rimangono all'interno (incluso lo strato epiteliale del pigmento).</li>
	<li>Posizionare la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.1.</li>
	<li>Trasferire la retina nel piatto di coltura cellulare p60 preparato al passaggio 3.1.2 e tagliarla con il bisturi in piccoli pezzi di dimensioni approssimative < 1 mm.</li>
	<li>Trasferimento in un tubo di plastica da 15 ml.</li>
	<li>Incubare il tessuto per 30 min, in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO2, con agitazione ogni 10 min.</li>
	<li>Dissociare i ciuffi cellulari tubazioni su e giù con una pipetta Pasteur in vetro.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Scartare il supernatante e inattivare la papaina, rimescolare il pellet cellulare nella soluzione preparata al passaggio 3.1.3. (1,5 mL per 2 occhi).</li>
	<li>Pipettare con cura questa sospensione cellulare in 5 mL di flaconcino ricostituito 4.</li>
	<li>Centrifuga a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, rimuovere completamente il mezzo ME-10 dalla piastra cellulare del pozzo OEG 24 (precedentemente preparata nel passaggio 2) e sostituirlo con 500 μL di mezzo NB-B27 per pozzo.</li>
	<li>Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 2 mL di mezzo NB-B27.</li>
	<li>Piastra 100 μL di sospensione cellulare retinica, per pozzo della piastra m24, su coprispalla monostrati OEG trattati con PLL.</li>
	<li>Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO2 per 96 h in mezzo NB-B27.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Dopo 96 ore, fissare le cellule per 10 minuti aggiungendo lo stesso volume del 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS al mezzo di coltura (600 μL) (concentrazione finale PFA 2%).</li>
	<li>Rimuovere il supporto e il PFA dalla piastra a 24 poliwell e aggiungere ancora una volta 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x PBS. Incubare per 10 minuti.</li>
	<li>Scartare il fissatore e lavare 3 volte con 1x PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Blocco con 0,1% Tritone X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) per 30-40 min.</li>
	<li>Preparare gli anticorpi primari nel tampone PBS-TS come segue: SMI31 (contro le proteine MAP1B e NF-H) anticorpo monoclonale (1:500). 514 (riconosce le proteine MAP2A e B) antisiero policlonale coniglio (1:400).</li>
	<li>Aggiungere anticorpi primari alle coculture e incubare durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>Il giorno dopo, scartare gli anticorpi e lavare le coverlips con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti.</li>
	<li>Preparare gli anticorpi secondari nel tampone PBS-TS come segue: Per SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Per 514, anti-coniglio Alexa-594 (1:500).</li>
	<li>Incubare le cellule con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti per 1 h, a RT, al buio.</li>
	<li>Lavare i copripavimenti con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti, al buio.</li>
	<li>Infine, montare i copripasto con supporto di montaggio(Tavolo deiMateriali) e mantenere a 4 °C. NOTA: Quando necessario, possono essere eseguiti nuclei fluorescenti contenenti DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolo). Prima del montaggio, incubare le cellule per 10 minuti al buio con DAPI (10 μg/mL in 1x PBS). Lavare le coverlips 3 volte con 1x PBS e infine montare i copripavimenti con il supporto di montaggio.</li>
</ol>5. Quantificazione della rigenerazione assionale
NOTA: I campioni sono quantificati nell'obiettivo 40x di un microscopio a epifluorescenza. Un minimo di 30 immagini dovrebbero essere scattate su campi casuali, con almeno 200 neuroni, da quantificare per ogni trattamento. Ogni esperimento deve essere ripetuto almeno tre volte.
<ol><li>Quantificare la percentuale di neuroni con assone (neurite positiva SMI31) rispetto alla popolazione totale di RGN (identificata con MAP2A/B 514 immunostaining positivo del corpo neuronale e dei dendriti).</li>
	<li>Quantificare l'indice di rigenerazione assonale o la lunghezza assionale media (μm/neurone). Questo parametro è definito come la somma delle lunghezze (in μm) di tutti gli assoni identificati, divisi per il numero totale di neuroni contati, indipendentemente dal fatto che presentavano o meno un assone. La lunghezza assonale è determinata utilizzando il plugin NeuronJ del software di immagini ImageJ (NIH-USA).</li>
	<li>Calcola la media, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando il software appropriato.</li>
</ol>

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<li>Wigley, C. B., Berry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+adult+rat+retinal+ganglion+cell+processes+in+monolayer+culture%3A+comparisons+between+cultures+of+adult+and+neonatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons.</a> Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).</li>
<li>Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+olfactory+nerve+ensheathing+cells+are+effective+promoters+of+adult+central+nervous+system+neurite+outgrowth+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture.</a> Glia. 25 (3), 256-269 (1999).</li>
<li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms%3A+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li>
<li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity%3A+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il trapianto OEG nei siti di lesione del SNC è considerato una terapia promettente per la lesione del SNC a causa delle sue proprietà pro-neuroregenerative costitutive7,8,9. Tuttavia, a seconda della sorgente tissutale — mucosa olfattiva (OM-OEG) rispetto al bulbo olfattivo (OB-OEG) — o dell'età del donatore, esistono notevoli variazioni in talecapacità 26,31,...

I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva dalla cresta neurale6 e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfattivo. Nell'adulto, i neuroni sensoriali olfattivi muoiono regolarmente a causa dell'esposizione ambientale e vengono sostituiti da neuroni appena differenziati. OEG circonda e guida questi nuovi assoni olfattivi per entrare nel bulbo olfattivo e stabilire nuove sinapsi con i loro obiettivi nel CNS7. A causa di questi attributi fisiologici, l'OEG è stato utilizzato in modelli di lesione del SNC come midollo spinale o lesione del nervo ottico e le sue proprietà neuroregenerative e neuroprotettivediventano dimostrate 8,9,10,11. Diversi fattori sono stati identificati come responsabili delle caratteristiche pro-rigenerative di queste cellule, tra cui la produzione o la secrezione di fattori di crescita neurotrofica e assonale12,13,14.
Date le limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie, abbiamo precedentemente stabilito e caratterizzato linee clonali OEG umane immortalate reversibili (ihOEG), che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Queste cellule ihOEG derivano da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie. Sono stati immortalati per trasduzione della subunità catalitica telomerasi (TERT) e dell'oncogene Bmi-1 e modificati con il virus SV40 grande antigene T15,16,17,18. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti18.
Per valutare la capacità dell'OEG di favorire la rigenerazione assonale dopo la lesione neurale, sono stati implementati diversi modelli in vitro. In questi modelli, l'OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e vengono saggiate la formazione e l'allungamento della neurite, in risposta alla cocoltura gliale. Esempi di tali fonti neuronali sono i neuroni corticali del ratto neonatale19, le ferite da graffio eseguite sui neuroni embrionali del ratto dal tessutocorticale 20,le espianto retinichedel ratto 21, i neuroni postnatali ipotalamici o ippocampali del ratto22,23, neuroni ganglionali della radice dorsale del ratto postnatale24, neuroni del tratto corticospinale del topo postnatale25,neuroni NT2umani 26o neuroni corticali cerebrali postnatali su colture reattive simili a cicatrici astrociti27.
In questi modelli, tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca che è assente nei neuroni adulti feriti. Per superare questo inconveniente, presentiamo un modello di rigenerazione assonale adulta in coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN), basato su quello originariamente sviluppatoda Wigley etal. In breve, il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti e digerito con papaina. La sospensione cellulare retinica viene quindi placcata su coverlips trattate con polilisina o su monostrati Ts14 e Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate e quindi viene eseguita l'immunofluorescenza per i marcatori assonale (proteine MAP1B e NF-H)34 e somatodendritica (MAP2A e B)35 marcatori. La rigenerazione assonale è quantificata come percentuale di neuroni con assone, rispetto alla popolazione totale di RGN e l'indice di rigenerazione assonale è calcolato come lunghezza assonale media per neurone. Questo protocollo non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

<table><tbody><tr><td>anticorpo 514</td><td>Riferimento 34</td><td></td><td>Antisiero policlonale di coniglio, che riconosce MAP2A e B.</td></tr><tr><td>anticorpo SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Anticorpo monoclonale contro le proteine MAP1B e NF-H</td></tr><tr><td>anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio Alexa Fluor 594 anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-2-ammino-5-acido fosfonovalerico</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>inibitore del recettore NMDA</td></tr><tr><td>DAPI Sigma</td><td></td><td>D9542</td><td>Colorazione fluorescente dei nuclei</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>11573397</td><td>Siero fetale bovino</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>16291082</td><td>Siero fetale bovino</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Supporto di montaggio</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH-USA)</td><td></td><td>Software di immagine</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Terreno di coltura di cellule neuronali</td></tr><tr><td>Sistema di dissociazione della papaina</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Per l'uso nell'isolamento delle cellule neurali</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/Amfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Estratto ipofisario batteriostatico e battericida</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Estratto ipofisario bovino</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Le cellule olfattive di glia ensheathing (OEG) sono localizzate dalla mucosa olfattiva a e nello strato nervoso olfattivo (ONL) del bulbo olfattivo. Per tutta la vita adulta, sono fondamentali per la crescita assonale dei neuroni olfattivi appena generati, dalla lamina propria all'ONL. A causa delle loro proprietà pro-rigenerative, queste cellule sono state utilizzate per favorire la rigenerazione assonale nel midollo spinale o nei modelli di lesione del nervo ottico.
Presentiamo un modello in vitro per testare e misurare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neurale. In questo modello, l'OEG umano reversibilmente immortalato (ihOEG) è coltivato come monostrato, le retine vengono estratte da ratti adulti e i neuroni ganglionari retinali (RGN) sono coculati sul monostrato OEG. Dopo 96 ore, i marcatori assonali e somatodendritici nelle RGN vengono analizzati per immunofluorescenza e il numero di RGN con assone e la lunghezza assionale media / neurone vengono quantificati.
Questo protocollo ha il vantaggio rispetto ad altri saggi in vitro che si basano su neuroni embrionali o postnatali, che valuta le proprietà neuroregenerative OEG nel tessuto adulto. Inoltre, non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.

In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro per testare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neuronale. Come mostrato nella Figura 1, la sorgente OEG è una linea cellulare clonale OEG immortalata reversibile -Ts14 e Ts12-, che deriva da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie15,17,18. Il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti, digerito e la...

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Il nostro protocollo è un modello semplice e riproducibile per valutare la capacità di avvolgimento olfattivo per favorire la rigenerazione assonale adulta Si tratta di una tecnica quantitativa che consente la valutazione della capacità rigenerativa della glia di rivestimento olfattivo che può essere estesa anche ad altri tipi di cellule gliali. Questa tecnica è il primo passo per studiare la glia che riveste l'olfatto come candidato per la terapia cellulare nelle lesioni del sistema nervoso prima di essere traslata in vivo o in studi clinici. A dimostrare la procedura sarà Maria Portela, dottoranda del nostro laboratorio.Per iniziare, prepara tutti i media necessari come descritto nel manoscritto del testo. Dopo aver sacrificato il topo, metti la sua testa in una capsula di Petri da 100 millilitri e spruzzala con etanolo al 70% prima di metterla in una cappa a flusso laminare. Taglia i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.Afferra il nervo ottico con una pinza per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter praticare un'incisione attraverso l'occhio con un bisturi. Rimuovi il cristallino e l'umor vitreo ed estrai la retina,

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

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In questo protocollo, abbiamo descritto un nuovo metodo per studiare l'influenza delle eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni con...

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

Questo video mostra la procedura per isolare i neuroni gangliari retinici (RGN) dalla retina di un ratto e cocoltivarli con cellule gliali che inguainano l'olfatto. Questo metodo consente di studiare il potenziale neuro-rigenerativo degli OEG dopo una lesione neurale.

Coculturazione dei neuroni gangliari retinici con glia inguainante olfattiva

Questo video mostra il modello di cocoltura di un espiante di ganglio della radice dorsale e cellule di Schwann. In condizioni di cocoltura, l'acido ascorbico promuove la differenziazione delle cellule di Schwann in forme mielinizzanti. Le cellule mielinizzanti di Schwann avvolgono gli assoni più volte per creare una guaina mielinica, essenziale per la funzione nervosa.

Co-coltura di un espiante di ganglio della radice dorsale con cellule di Schwann per la mielinizzazione dei neuroni

Fonte: Cheah, M., et al. Iniezione del ganglio della radice dorsale e lesione da schiacciamento della radice dorsale come modello per la rigenerazione sensoriale degli assoni. J. Vis. Exp. (2017). Questo video mostra una procedura passo-passo per iniettare una sospensione virale nei gangli della radice dorsale (DRG) e indurre una lesione assonale controllata attraverso uno schiacciamento della radice dorsale in un ratto anestetizzato. Il protocollo prevede l'esposizione dei DRG, la...

Modellazione della rigenerazione sensoriale degli assoni in un ratto utilizzando l'iniezione del ganglio della radice dorsale e la lesione da schiacciamento della radice dorsale

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguainante olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020).Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione della rigenerazione assonale in neuroni gangliari retinici di ratto axotomizzati (RGN) co-coltivati con cellule gliali di rivestimento olfattivo umano immortalizzate. Gli RGN sono immunomarcati, con soma rossi e assoni verdi. Le immagini...

Imaging e quantificazione della rigenerazione assonale nei neuroni del ganglio retinico di ratto assotomizzati

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Questo protocollo presenta l'uso di un'iniezione di ganglio della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e una concomitante lesione da schiacciamento della radice dorsale in un ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione sensoriale degli assoni. Questo modello è adatto per studiare l'uso della terapia genica per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Scopri un modello di cocultura in vitro per valutare la rigenerazione assonale nei neuroni ganglionali retinici di ratto adulti utilizzando la glia ensheathing olfattiva. Questo metodo quantitativo supporta lo studio di potenziali terapie cellulari per lesioni del sistema nervoso.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta (Video) | JoVE Journal

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

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