Un metodo di perfusione antegrada per l'isolamento dei cardiomiociti dai topi
19 maggio 2021
Abbiamo sviluppato un metodo semplicie per isolare le singole cellule cardiache del topo di alta qualità con la tecnica della perfusione antegrada. Questo metodo è privo di Langendorff e utile per isolare miociti ventricolari e atriali o cellule interstiziali, come fibroblasti cardiaci o progenitori.
Abbiamo sviluppato un semplice metodo privo di Langendorff per isolare le singole cellule cardiache del topo con una tecnica di imballaggio antigrado. Questo metodo consente l'isolamento delle cellule cardiache dai topi giovani a quelli più anziani. La perfusione retrograda a base di Langendorff è stata considerata un gold standard per l'isolamento dei miociti cardiaci in vari animali da esperimento.
Tuttavia, la cannulazione dell'LTA è tecnicamente difficile nei topi a causa delle loro piccole dimensioni. Per la raccolta del cuore del topo, dopo aver confermato l'eutanasia e aver rasato l'addome, aprire rapidamente la cavità toracica per esporre il cuore e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata approssimativamente alle dimensioni del cuore per succhiare il cuore nella pipetta. Sollevare la pipetta per creare spazio sufficiente per inserire forbici curve e utilizzare le forbici per asportare il cuore dal lato dorsale facendo attenzione a evitare di danneggiare gli atri.
Immediatamente, posizionare il cuore in un bicchiere da 30 millilitri contenente CIB-EGTA ghiacciato per circa un minuto. Quando le contrazioni si sono fermate, mettere il cuore in un piatto di coltura da 35 millilitri contenente CIB-EGTA ghiacciato e rimuovere il polmone e altri tessuti visibili. Posizionare il cuore appena pulito su un supporto cardiaco pieno di lato apice CIB-EGTA refrigerato verso il basso e posizionare il supporto sotto un microscopio stereoscopico.
Rimuovere il grasso e i tessuti connettivi da intorno all'aorta. Se la lunghezza dell'aorta tagliata è troppo lunga, tagliare l'aorta appena sotto l'arteria brachiocefalica e orientare il cuore in modo che la superficie anteriore sia rivolta in avanti. Utilizzare una pinzetta per sollevare l'estremità dell'aorta e utilizzare un piccolo morsetto vascolare per bloccare l'aorta vicino all'atria mentre si spinge delicatamente verso il basso sugli atri.
Quindi posizionare il cuore bloccato su una piastra di perfusione con il lato anteriore rivolto verso l'alto e idratare il cuore con alcune gocce di CIB-EGTA. Per la perfusione antegrada, caricare una siringa da 20 millilitri contenente CIB-EGTA prebellico collegato a un tubo di estensione flessibile e un ago di iniezione marcato sulla pompa per infusione e avviare la pompa a una portata di 0,5 millilitro al minuto. Quando l'ago e la pompa sono stati riempiti, posizionare l'ago di iniezione sulla piastra di perfusione con il lato più corto della forma diagonale davanti e far scorrere l'ago fino a quando non tocca solo l'apice del cuore.
Con attenzione, inserire l'ago vicino all'apice del ventricolo sinistro nella camera ventricolare senza torcere o staccare l'ago dalla piastra, osservando il segno per stimare la profondità dell'inserimento dell'ago. Quando l'inserimento dell'ago è completo, il sangue dovrebbe iniziare a fluire dall'arteria coronarica. Utilizzare il nastro adesivo per fissare l'ago di iniezione alla piastra e aumentare la velocità della pompa a un millilitro al minuto.
Se il cuore viene perfuso con successo, il flusso del tampone nel capillare dovrebbe essere visibile appena sotto l'epicardio. Dopo due o tre millilitri di perfusione CIB-EGTA, sostituire il tampone perfusione con mix enzimatico. Dopo aver perfuso da uno a due millilitri, aumentare la velocità della pompa a 1,5 millilitri al minuto.
Utilizzare una pipetta per rimuovere il perfusato accumulato contenente sangue che scorre dal cuore se necessario e interrompere la perfusione quando il volume totale di enzima perfuso raggiunge i 10 millilitri. Alla fine della perfusione, trasferire 10 millilitri di miscela enzimatica dalla siringa a un piatto di coltura di 60 millimetri su un tappetino riscaldante e aggiungere 20 milligrammi di BSA al piatto. Ruotare delicatamente il piatto per sciogliere la polvere e rimuovere l'ago di iniezione e il morsetto dal cuore.
Rimuovere i ventricoli e gli atri dal cuore e posizionare i tessuti nel mix enzimatico integrato in BSA. Per isolare i miociti ventricolari, utilizzare due paia di pinzette per afferrare l'epicardio e tirare delicatamente i ventricoli in piccoli pezzi. Una volta generati tutti i frammenti del ventricolo, disperdere le cellule circa 30 volte con una tubazione delicata e filtrare i detriti non digeriti attraverso un filtro cellulare a rete da 100 micron in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Dopo la centrifugazione, resospendare il pellet di cardiomiocita nel CIB prebellico integrato con calcio e BSA e incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente le cellule e rimosopendire i cardiomiociti precipitati in un volume appropriato di soluzione di resuspensione cellulare per il loro mantenimento a 37 gradi Celsius fino all'analisi a valle. Per isolare i miociti atriali, trasferire gli atri in un contenitore di CIB prebellico integrato con calcio e BSA e strappare gli atri in pezzi come dimostrato.
Utilizzare una pipetta da 20 microlitri impostata su 10 microlitri per interrompere i tessuti tubazionando e raccogliere le cellule dissociate mediante centrifugazione. Quindi rimosodire la cella atriale in un volume appropriato di soluzione di resuspensione cellulare. In questa immagine, si possono osservare miociti ventricolari appena isolati.
Questa procedura di isolamento si traduce in una resa dal 70 all'80% di miociti ventricolari quiescenti a forma di bastone da otto a 10 settimane entro circa cinque ore dall'isolamento. Il rapporto tra cellule vitali appena isolate è inferiore nei topi di età superiore ai due anni. I potenziali d'azione registrati nei miociti ventricolari e atriali sono simili a quelli misurati nelle cellule ottenute con il metodo basato su Langendorff.
L'analisi immunostaining può essere utilizzata per valutare l'organizzazione della struttura sarcomerica dei miociti ventricolari e la trasformazione dei fibroblasti cardiaci in miofibroblasti dopo la sottocultura. L'analisi western blot è raccomandata per determinare l'espressione specifica delle proteine di interesse negli atri e nei ventricoli dopo la lavorazione. Dopo la perfusione con enzimi, le proteine degli atri e dei ventricoli possono essere facilmente omogeneizzate nel tampone di lysis con forza leggera per l'estrazione delle proteine.
È importante controllare la direzione e le profondità dell'inserimento dell'ago. Quando si inserisce l'ago nel ventricolo sinistro, fare attenzione a non perforare il setto ventricolare o a penetrare nella valvola. È possibile modificare la composizione del perfusato a seconda dello scopo dell'esperimento.
Ad esempio, un detergente integrato EGTA può essere utilizzato per realizzare un'impalcatura senza cellule del cuore.
Panoramica
Questo studio affronta la sfida dell'isolamento di singole cellule cardiache di topo, fondamentali per la ricerca cardiaca. Gli autori hanno sviluppato un metodo privo di Langendorff che utilizza una perfusione anterograda per isolare in modo efficiente le cellule da topi di diverse età, migliorando notevolmente l'accesso a specifici tipi cellulari cardiaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Isolamento di cellule cardiache
- Biologia del cuore del topo
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- I metodi tradizionali di Langendorff presentano difficoltà tecniche nei topi a causa delle loro dimensioni ridotte.
- L'isolamento cellulare è fondamentale per comprendere la funzione cardiaca e la patologia.
- Lo sviluppo di metodi accessibili avvantaggia un'ampia gamma di studi cardiaci.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di perfusione anterograda
- Sistema modello murino
- Utilizzo di tamponi ed enzimi specifici per la dissociazione cellulare
Risultati principali
- Isolamento efficiente di miociti ventricolari e atriali con elevata vitalità cellulare (resa del 70-80%).
- Potenziali d'azione cellulari simili a quelli ottenuti con metodi Langendorff.
- Passaggi procedurali dettagliati per un'estrazione cellulare ottimale.
Conclusioni
- Questo studio presenta un metodo semplificato ed efficace per isolare cellule cardiache da cuori di topo.
- L'approccio riveste un'importanza fondamentale per lo sviluppo delle metodologie di ricerca cardiaca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento efficiente di cardiomiociti vitali da cuori di topo è un fattore abilitante fondamentale per le scoperte iniziali e gli studi meccanicistici nella ricerca farmacologica cardiovascolare. Il metodo di perfusione anterograda elimina gli ostacoli tecnici associati alla perfusione retrograda basata sul sistema di Langendorff, ampliando l'accesso a cellule cardiache di alta qualità in un'ampia gamma di età dei topi. Questa capacità supporta una valida conferma del bersaglio e saggi funzionali, influenzando direttamente l'affidabilità predittiva dei percorsi di ricerca e sviluppo cardiovascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di ipotesi specifiche per il cuore mediante miociti ventricolari e atriali isolati di fresco.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo cellule ad alta vitalità per saggi funzionali e molecolari.
- Facilita studi meccanicistici sui tipi cellulari cardiaci, migliorando la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un isolamento standardizzato e riproducibile di cardiomiociti e fibroblasti per lo sviluppo di saggi successivi.
- Consente rese cellulari quantitative adatte ad analisi elettrofisiologiche e di espressione proteica.
- Permette la preparazione di sistemi cellulari cardiaci validati per lo screening di composti e letture funzionali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli cardiaci rilevanti per le malattie grazie alla possibilità di isolamento da topi giovani fino a quelli anziani.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, mantenendo una qualità e vitalità cellulare costanti.
- Permette studi traslazionali su biomarcatori grazie alla compatibilità con analisi di immunomarcatura e Western blot.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di perfusione anterograda si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo una fonte affidabile di cellule cardiache primarie per la verifica delle ipotesi, lo sviluppo di saggi e la riduzione del rischio meccanicistico.
- Biologia della Scoperta: Permette test robusti dell'ipotesi nulla e chiarificazione dei percorsi metabolici utilizzando cardiomiociti appena isolati.
- Screening: Fornisce preparazioni cellulari quantitative e riproducibili per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Supporta letture quantitative come misurazioni del potenziale d'azione e profili di espressione proteica.
- Ricerca Translazionale: Facilita l'allineamento con modelli di malattia e la validazione di biomarcatori mediante isolamento cellulare di alta qualità.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un protocollo scalabile e standardizzato adattabile tra diversi gruppi di ricerca e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cardiaci.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'isolamento delle cellule cardiache.
- Valore strategico: Consente decisioni più accurate di avanzamento/cessazione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli cardiovascolari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la promozione di programmi di scoperta cardiaca adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche in dissezione microchirurgica e perfusione sotto microscopio stereoscopico.
- Necessita dell'accesso a pompe per infusione, tappetini riscaldanti e infrastrutture analitiche per saggi successivi.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro dei parametri di perfusione e dei protocolli di manipolazione cellulare.
- Adattabile a diverse età dei topi, ma il rendimento cellulare e la vitalità possono diminuire negli animali più anziani.
- Un controllo accurato della profondità di inserimento dell'ago e della composizione del perfusato è essenziale per la riproducibilità.
