Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Tutte le proteine di membrana sono bersagli importanti nella scoperta di farmaci. La produzione su larga scala di proteine di membrana rimane un collo di bottiglia per condurre studi biochimici, biofisici e strutturali sulle proteine di membrana. Questo metodo può essere utilizzato per sintetizzare in modo efficiente le proteine di membrana in vitro e per preparare proteoliposomi purificati in breve tempo con un alto tasso di successo.

Dopo aver aggiunto i reagenti appropriati, compreso il plasmide di espressione libero da cellule per generare una miscela di reazione di trascrizione, mescolare il contenuto della provetta mediante inversione delicata o picchiettamento ed eseguire una rapida centrifuga in una microcentrifuga. Dopo la centrifuga, incubare la miscela di reazione di trascrizione per sei ore a 37 gradi Celsius, seguita dalla miscelazione e da una fase di centrifuga. Per preparare il tampone di traduzione, diluire la soluzione madre con acqua fresca ultrapura.

Per la traduzione su piccola scala, utilizzare coppette per dialisi da 100 microlitri lavate con acqua ultrapura per rimuovere il glicerolo dalla membrana di dialisi. Aggiungere un millilitro di acqua ultrapura a una nuova provetta da 1,5 millilitri e inserire una tazza per dialisi su piccola scala nella provetta. Quindi aggiungere 500 microlitri di acqua ultrapura alla tazza per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.

Per preparare i liposomi, trasferire una soluzione lipidica contenente 50 milligrammi di lipidi in un pallone di evaporazione. Mettere il pallone in un evaporatore rotante per far evaporare il solvente. Quando si è generato uno strato sottile e uniformemente distribuito di lipidi sulla superficie del pallone, trasferire il pallone in un essiccatore sottovuoto a pressione negativa durante la notte per rimuovere completamente il solvente.

La mattina successiva, togliere i palloni dall'essiccatore e controllare il sottile film di lipidi. Aggiungere un millilitro di tampone di traslazione al pallone e ruotare il pallone per distribuire il tampone sul sottile film lipidico. Dopo cinque minuti, sonicare il pallone cambiando di tanto in tanto l'angolo per consentire alla soluzione di entrare in contatto con l'intera superficie del film lipidico.

Interrompere la sonicazione quando il lipide è completamente rimosso dal pallone e la sospensione liposomica diventa uniforme. Quindi trasferire la sospensione liposomica in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Prima di eseguire una traduzione proteica in vitro, far galleggiare un tubo di estratto di germe di grano da una conservazione a meno 80 gradi su acqua a temperatura ambiente per alcuni minuti per scongelare rapidamente il materiale.

Dopo aver scongelato l'estratto, mescolare immediatamente il contenuto del tubo mediante leggera inversione. Quindi girare verso il basso e posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere l'mRNA dell'estratto di germe di grano e i liposomi per generare una miscela di reazioni di traduzione.

Mescolare il contenuto della provetta mediante leggera inversione o picchiettamento ed eseguire una centrifuga rapida in una microcentrifuga. Per eseguire una traduzione proteica in vitro su piccola scala, rimuovere l'acqua dalla tazza e dalla provetta per dialisi su piccola scala e aggiungere un millilitro di tampone di traduzione alla provetta e 300 microlitri alla tazza. Assumere 60 microlitri di miscela di reazioni di traduzione.

Inserire il puntale della pipetta nel tampone di traduzione nella tazza per dialisi. Quindi iniettare la miscela lentamente e delicatamente. La miscela di reazione con densità più elevata affonda spontaneamente sul fondo della tazza e forma uno strato.

Coprite la tazza con un coperchio per evitare che evapori. Per eseguire una traslazione su larga scala, aggiungere 22 millilitri di tampone di traduzione a una provetta da 25 millilitri e posizionare una tazza per dialisi da due millilitri nella provetta. Aggiungere due millilitri di tampone di traduzione alla tazza per dialisi.

Prelevare 500 microlitri della miscela di reazione di traduzione, iniettare lentamente e delicatamente la miscela nel tampone di traduzione nella tazza. Incubare le reazioni per 24 ore a 15 gradi Celsius. Il giorno successivo miscelare accuratamente la reazione nella tazza per dialisi pipettandola e trasferendo le sospensioni grezze di proteoliposoma in nuove provette.

Per purificare i proteoliposomi, sedimentare il proteoliposoma nelle sospensioni grezze mediante centrificazione. Quindi lavare il proteoliposoma risospendendo tre volte nel volume appropriato di tampone PBS ghiacciato. Dopo il lavaggio, risospendere accuratamente i pellet di proteoliposoma in un piccolo volume di PBS e misurare il volume di sospensione utilizzando una micropipetta.

Quindi aggiungere PBS per regolare il volume della sospensione. Trasferire ogni sospensione in un nuovo microtubo. Per impostare un'analisi della pagina SDS, aggiungere 70 microlitri di acqua e 40 microlitri di tampone campione di pagina SDS concentrato tre volte a 10 microlitri di ciascuna sospensione di proteoliposoma.

Impostare un gel per pagine SDS con gradiente dal cinque al 20% in una camera di elettroforesi. Caricare il gel con due microlitri del marcatore dimensionale della proteina tre, sei e 12 microlitri di ciascun campione di proteoliposoma e 10 microlitri di standard di albumina sierica bovina. Dopo aver caricato i campioni, eseguire l'elettroforesi seguita dalla colorazione del gel con il colorante Coomassie Brilliant Blue.

Infine, decolorare il gel in acqua calda agitando delicatamente e scansionare l'immagine del gel. Utilizzando questo protocollo, come dimostrato, una varietà di proteine di membrana con tre o più eliche transmembrana può essere facilmente prodotta come proteoliposomi in breve tempo. In questo metodo di dialisi a doppio strato, l'alimentazione continua di substrati e la rimozione del sottoprodotto possono essere condotte in modo efficiente sia nella parte superiore che in quella inferiore della miscela di reazione per un lungo periodo di tempo, portando a un'eccellente efficacia di traslazione.

Il metodo di dialisi a doppio strato comporta un aumento della produttività da quattro a 10 volte rispetto all'utilizzo dei soli metodi a doppio strato o di dialisi. La raccolta dei proteoliposomi sintetizzati mediante centrificazione e la loro parziale purificazione con un tampone di lavaggio accorcia notevolmente il processo di purificazione delle proteine di membrana. Questo sistema senza celle è facile da manipolare e altamente scalabile.

Può anche essere utilizzato per produrre proteine della memoria che sono difficili da esprimere con altri metodi. Questo metodo è estremamente utile per le indagini e gli esperimenti che utilizzano o prendono di mira proteine di membrana come la proteina antimembrana, la produzione di anticorpi, SPR, Elisa e AlphaScreen.