Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Il nostro protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere gli effetti fisiologici di tre diversi metodi di trapianto di midollo osseo e come influenzano i risultati sperimentali nell'impostazione dell'ematopoiesi clonale. Il trapianto totale di midollo osseo con radiazioni corporee può avere un impatto negativo sugli organi cardiovascolari e alterare la patogenesi della malattia. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali.

A dimostrare le procedure saranno Eunbee Park, una studentessa laureata, e Megan Evans un post-dottorato, entrambi del mio laboratorio Per la schermatura del torace e dell'addome, posizionare il vassoio regolabile e l'irradiatore a raggi X alla giusta distanza per ottenere un'irradiazione uniforme. E posizionare i topi anestetizzati su una piastra a led piatta invertita l'uno all'altro in posizione supina. Fissare le zampe alla piastra con del nastro adesivo e posizionare la schermatura a led in modo che l'estremità inferiore si allinei con l'osso xiphisternum e l'estremità superiore dello scudo di piombo si si sieda vicino al timo.

Dopo la schermatura, posizionare i topi nell'irraggiatore ed esporre gli animali a due frazioni grigie di irradiazione di 5,5 ore separate da un intervallo di quattro-24 ore. Per la schermatura della testa, rastremi attentamente le quattro zampe del mouse all'addome. Posizionare il mouse in un limitatore conico e far scorrere il trattino nella fessura all'interno dello scudo di piombo in modo che la testa e le orecchie del mouse siano completamente coperte, lasciando il resto del corpo del mouse esposto per una radiazione.

Dopo la schermatura posizionare i topi nell'irradiatore ed esporre gli animali a 5,5 frazioni grigie di una radiazione separate da un intervallo di quattro-24 ore. Dopo ogni trattamento con radiazioni, posizionare i topi anestetizzati in una gabbia su un tappetino riscaldato con monitoraggio fino a completo recupero. Per isolare le ossa, disinfettare la pelle del topo donatore con il 70% di etanolo e fare una piccola incisione trasversale della pelle sotto la gabbia toracica.

Tenendo la pelle saldamente su entrambi i lati dell'incisione, strappare in direzioni opposte verso la testa e i piedi e sbucciare la pelle da tutti gli arti. Tagliare le spalle e le articolazioni del gomito e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere i muscoli attaccati e i tessuti connettivi dagli humeri. Dislocare con cura le articolazioni tra il femore e le ossa dell'anca.

E usa forbici smussate per tagliare lungo le teste del femorale per staccare le gambe. Tagliare sopra l'articolazione del ginocchio, per separare il femore e la tibia. E usa le salviette da laboratorio per rimuovere con cura i muscoli attaccati e i tessuti connettivi dalle ossa.

Quindi estrarre le ossa dai topi dello stesso genotipo in singoli tubi conici da 50 millilitri contenenti 20 millilitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per isolare le cellule del midollo osseo in un armadio di classe due di biosicurezza, utilizzare un ago calibro 18 per fare un piccolo foro nella parte inferiore di un microtubo sterile da 500 microliter. E posizionare il tubo in un singolo tubo sterile di micro centrifuga sterile da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile freddo ghiaccio.

Una volta preparati tutti i tubi, rimuovere il PBS dal tubo contenente le ossa isolate e trasferire le ossa su un piatto sterile di coltura cellulare da 100 millimetri. Utilizzare forcep fini e piccole forbici per rimuovere con cura l'epifisi dalle estremità di ogni osso e posizionare fino a sei ossa in ogni tubo da 500 microliter. Quando tutte le ossa sono state tagliate, estrarre le cellule del midollo osseo per centrifugazione.

Se tutto il contenuto di midollo è stato rimosso, le ossa dovrebbero apparire bianche e traslucide con un pellet rosso relativamente grande nella parte inferiore del tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Per il trapianto di cellule del midollo osseo, diluire le cellule isolate del midollo osseo in mezzi RPMI senza siero e caricare 200 microlitri della sospensione cellulare in una siringa per insulina da 0,5 millilitri per topo da iniettare. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, iniettare lentamente l'intero volume delle cellule nella vena orbitale retrò di ogni animale ricevente anestetizzato.

Quindi posizionare una goccia di proparacaina sull'occhio per alleviare il dolore. E permettere al topo di riprendere conoscenza mentre viene monitorato. Confrontare l'effetto di tre metodi di precondizione BMT sull'innesto cellulare del donatore.

Le frazioni di cellule donatrici nel sangue periferico e nel tessuto cardiaco sono state analizzate dalla citometria del flusso a un mese dopo la BMT. In questa analisi rappresentativa, nel sangue periferico dei topi riceventi che hanno ricevuto l'irradiazione totale del corpo, monociti, neutrofili e cellule B sono stati in gran parte ablati e sostituiti dalla progenie delle cellule derivate dal midollo osseo donatore. Inoltre, le popolazioni di monociti cardiaci e neutrofili riceventi residenti sono state quasi completamente sostituite da cellule derivate dal donatore.

Nel gruppo di irradiazione parzialmente schermato, la sostituzione delle cellule immunitarie cardiache derivata dal donatore era modesta. Le cellule del midollo osseo del topo ricevente all'interno delle regioni schermate hanno probabilmente contribuito al livello inferiore di ricostituzione del sangue periferico rispetto ai topi che hanno ricevuto l'irradiazione totale del corpo. Nel gruppo senza precondizione BMT, le cellule derivate dal donatore erano rilevabili nel sangue periferico e nel cuore dei topi riceventi a quattro settimane dopo la BMT.

Inoltre, le cellule donatrici carenti di Tet2 si espansero gradualmente nel tempo. In confronto, i topi ricevente innestati con cellule donatrici di tipo selvatico hanno mostrato una minima espansione clonale delle cellule donatrici. L'ottimizzazione di questi modelli sperimentali consentirà studi più rigorosi dei geni del driver dell'ematopoiesi clonale che contribuiscono a tutte le cause di mortalità come le malattie cardio-metaboliche e il cancro.

Speriamo che i nostri protocolli consentano ai ricercatori di studiare l'ematopoiesi clonale per indagare come contribuisce alle malattie cardiovascolari e ad altri stati di malattia.