Name: Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare lematopoiesi clonale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri tre metodi di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale. Queste procedure alternative riducono gli effetti collaterali dell'irradiazione totale sul sistema cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dei National Institutes of Health degli Stati Uniti a K. Walsh (HL131006, HL138014 e HL132564), a S. Sano (HL152174), sovvenzione dell'American Heart Association a M. A. Evans (20POST35210098) e una sovvenzione della Japan Heart Foundation a H. Ogawa.

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.
1. Prima della precondizione
<ol><li>Posizionare i topi ricevente sull'acqua integrata da antibiotici (5 mM di sulfamethoxazolo, 0,86 mM trimetooprim) ~24 ore prima dell'irradiazione. Ciò è necessario per prevenire l'infezione, poiché il sistema immunitario verrà soppresso dopo l'irradiazione e mantenuto per 2 settimane dopo l'irradiazione. A questo punto, integrare i topi con un gel nutrizionale / idratazione per incoraggiare l'alimentazione e prevenire la perdita di peso e la disidratazione dopo l'irradiazione.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg"> Figura 1: Immagini che mostrano varie configurazioni di precondizione. (A) Impostazione dell'irradiazione totale del corpo a gabbia a torta mediante raggi gamma (Cesio-137): il fascio di radiazioni proviene dalla parte posteriore dell'irradiatore nella direzione dell'asse y (radiazione orizzontale). (B) Configurazione totale dell'irradiazione del corpo della gabbia del topo mediante raggi X: la gabbia del topo è posizionata nella camera riflettente. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte superiore dell'irradiatore a forma di cono (radiazione verticale). La distanza dalla sorgente di radiazioni alla gabbia è di 530 mm (C) Vassoio regolabile nell'irradiatore a raggi X: questa configurazione viene utilizzata per l'irradiazione parzialmente schermata utilizzando raggi X. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte superiore dell'irradiatore a forma di cono (radiazione verticale). La distanza dalla sorgente di radiazioni al vassoio è di 373 mm, e il raggio è di 250 mm. (D) Schermatura del torace: i topi anestetizzati sono posizionati su un vassoio. I topi sono posti l'uno verso l'altro in posizioni supine con braccia e gambe completamente estese. L'estremità inferiore dello scudo di piombo è allineata con l'osso xiphisternum e l'estremità superiore con il timo. (E) Schermatura addominale: i topi anestetizzati sono collocati come nell'impianto di schermatura del torace con l'estremità inferiore dello scudo di piombo allineata con l'ano e l'estremità superiore sotto il diaframma. (F) Impostazione dell'irradiazione di schermatura della testa mediante raggi gamma (Cesio-137): le prole del mouse anestetizzato sono annoate verso il basso e il mouse è posto in un limitatore conico. Lo scudo nero di piombo (marcato) copre la testa e le orecchie del topo. Il fascio di radiazioni proviene dalla parte posteriore dell'irradiatore nella direzione dell'asse Y (radiazione orizzontale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Precondizione dei topi riceventi (facoltativo)
<ol><li>Irradiazione totale del corpo
	<ol>
<li>Posizionare i topi riceventi in una gabbia a fette uniformi o in una gabbia per topi nella camera riflettente entro il raggio calcolato per ricevere la stessa dose di irradiazione; si raccomanda tuttavia un massimo di 8 topi per gabbia per torta e 5 topi per gabbia per topi per garantire un'irradiazione uniforme (figura 1A,B).</li>
		<li>Per ottenere una mieloablazione completa, assicurarsi che i topi riceventi ricevano una dose totale di radiazioni di 11 Gy in due frazioni di Gy 5.5 separate da un intervallo di 4-24 ore. NOTA: Sebbene sia possibile ottenere un innesto ottimale implementando un intervallo di 4 ore tra le frazioni, questo può essere esteso a un intervallo di 24 ore, che può essere utile quando il travaglio e /o l'irradiatore non è disponibile.</li>
	</ol></li>
	<li>Irradiazione parzialmente schermata
	<ol>
<li>Anestetizzare i topi riceventi per iniezione intraperitoneale di chetamina (80-100 mg/kg) e xilaazina (5-10 mg/kg). Il contenimento del movimento del topo è fondamentale per garantire l'irradiazione uniforme e l'efficace protezione degli organi di puntamento durante il processo di schermatura.</li>
		<li>Per la schermatura del torace e dell'addome, orientare verticalmente il fascio di radiazioni dell'irradiatore a raggi X verso il topo (figura 1C).<ol>
<li>Posizionare i topi anestetizzati su una piastra piatta, centrando la sorgente di radiazioni dall'alto. Posizionare i topi invertiti l'uno all'altro in posizione supina con braccia e gambe completamente estese(figura 1D,E). NOTA: L'impianto di irraggiamento a raggi X, per questo esperimento, consente di posizionare due topi alla volta entro il raggio effettivo che consente un'irradiazione uniforme. Mentre il raggio effettivo è calcolato in base alla distanza tra la sorgente di radiazioni e il vassoio, il numero di animali che possono essere simultaneamente irradiati dipenderà dall'irradiatore specifico.</li>
			<li>Fissare le zampe dei topi sulla piastra usando il nastro adesivo per garantire che i topi siano immobilizzati durante la procedura di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che copra le aree che richiedono protezione.</li>
			<li>Per la schermatura del torace, preparare lo scudo di piombo misurando la lunghezza dall'osso xiphisternum del topo al timo e calcolando lo spessore che fornirà una protezione sufficiente dalla fonte di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che l'estremità inferiore si allinei all'osso xiphisternum. L'estremità superiore della barriera al piombo si adatta vicino al timo(Figura 1D).</li>
			<li>Per la schermatura dell'addome, preparare lo scudo di piombo misurando la lunghezza dall'ano del topo al diaframma e calcolando lo spessore che fornirà una protezione sufficiente dalla fonte di irradiazione. Posizionare la schermatura del piombo in modo che l'estremità inferiore si allinei all'ano. L'estremità superiore dello scudo di piombo si adatterà al diaframma (Figura 1E). NOTA: Localizzare lo scudo di piombo per essere coerente tra le coorti può ridurre alcune variazioni per quanto riguarda le dimensioni dei topi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per la schermatura della testa, orientare il fascio di radiazioni dell'irradiatore del Cesio orizzontalmente verso il topo.<ol>
<li>Rastremi attentamente le sopracciglia di un topo anestetizzato all'addome. Ciò garantisce che le braccia otteniamo una dose completa di irradiazione e non sono coperte dallo scudo.</li>
			<li>Per la schermatura della testa, posizionare il mouse in un limitatore conico, che si inserisce all'interno di uno scudo di piombo. Una volta che il mouse si trova all'interno del limitatore conico, far scorrere il trattino nello slot all'interno dello scudo di piombo (Figura 1F). Lo scudo di piombo dovrebbe coprire completamente la testa e le orecchie del topo (~ 3,2 cm), lasciando il resto del corpo del topo esposto all'irradiazione. La posizione del limitatore all'interno dello scudo può essere regolata per adattarsi ad animali di diverse dimensioni facendola scorrere più all'interno o all'esterno dello scudo.</li>
			<li>Posizionare i topi all'interno dell'irradiatore, perpendicolare alla fonte per l'irradiazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Esporre i topi a due frazioni di irradiazione 5.5 Gy (dose totale di 11 Gy) separate da un intervallo di 4-24 ore.</li>
		<li>Dopo ogni frazione di irradiazione, posizionare le gabbie con topi anestetizzati su tappetini riscaldati o sotto lampade a calore rosso per prevenire l'ipotermia e aiutare nel recupero dall'anestesia. NOTA: Si deve fare attenzione a non surriscaldare il mouse anestetizzato quando si utilizza una lampada poiché non possono sfuggire al calore. Come descritto in precedenza, il posizionamento degli animali e lo spessore dello scudo di piombo possono differire tra gli studi basati sulle caratteristiche specifiche del radiatore (tipo di radiazione/direzione del fascio, ecc.). I ricercatori dovranno adeguare di conseguenza i loro esperimenti.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento osseo
NOTA: Idealmente, i topi donatori e i topi ricevente dovrebbero avere un'età simile e entro 8-12 settimane. L'uso di almeno 3 topi come donatori (piuttosto che come singolo donatore) è preferito per ridurre al minimo l'eterogeneità (anche quando si usano topi con lo stesso genotipo). Approssimativamente, 40 milioni di cellule del midollo osseo nonfrazionate possono essere ottenute da sei ossa (due femminicidi, due tibia e due humeri) di un singolo topo. Il trapianto di 5 milioni di cellule del midollo osseo in ogni topo ricevente garantirà in genere l'innesto.
<ol><li>Eutanasia dei topi donatori mediante lussazione cervicale senza anestesia (metodo preferito per evitare la contaminazione chimica delle cellule) e posizionare ogni topo su un cuscinetto assorbente.</li>
	<li>Disinfettare la pelle con uno spray al 70% di etanolo.</li>
	<li>Fai un piccolo taglio trasversale nella pelle sotto la gabbia toracica e tieni la pelle saldamente su entrambi i lati dell'incisione, strappa in direzioni opposte verso la testa e i piedi. Stacca la pelle da tutti gli arti.</li>
	<li>Tagliare sulle spalle e sulle articolazioni del gomito e rimuovere i muscoli attaccati e i tessuti connettivi con l'aiuto di un Kimwipe per ottenere l'humeri.</li>
	<li>Dislocare con cura le articolazioni dell'anca tra il femore e le ossa dell'anca. Usa forbici smussate per tagliare lungo la testa del femore e staccare le gambe. Tagliare sopra l'articolazione del ginocchio per separare il femore e la tibia e rimuovere con cura i muscoli attaccati e i tessuti connettivi con l'aiuto di un Kimwipe per raccogliere il femore e la tibia. NOTA: Prestare particolare attenzione a mantenere intatta l'epifisi ossea durante questo passaggio. Scartare eventuali ossa rotte a causa della perdita di sterilità. Ossa dell'anca e ossa della colonna vertebrale possono essere raccolte oltre al femore, alla tibia e all'omero. Per raccogliere ossa della colonna vertebrale, un mortaio e un pestello possono essere usati per schiacciare le ossa a pezzi e raccogliere le cellule del midollo osseo.</li>
	<li>Posizionare le ossa isolate dai topi dello stesso genotipo in un tubo conico di 50 ml contenente PBS sterile a freddo ghiaccio da 20 ml e tenerlo sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Prestare particolare attenzione a posizionare correttamente le ossa in tubi con genotipi abbinati.</li>
	<li>Ripetere i passaggi precedenti per ogni animale donatore che cambia guanti tra ogni topo. Inoltre, forbici pulite e altri strumenti con 70% di etanolo tra ogni topo.</li>
</ol>4. Isolamento delle cellule del midollo osseo
NOTA: eseguire i passaggi seguenti in un archivio di classe II per la biosicurezza.
<ol><li>Preparazione dei set di tubi: Fare un piccolo foro nella parte inferiore di un tubo sterile di microcentrifugo da 0,5 ml utilizzando un ago da 18 G e posizionarlo in un tubo sterile a microcentrifugo da 1,5 ml, che contiene 100 μL di PBS sterile ghiacciato nella parte inferiore. NOTA: Poiché solo sei ossa possono adattarsi al tubo di microcentrifugo da 0,5 ml, si consiglia di preparare set di tubi sufficienti per elaborare tutte le ossa contemporaneamente.</li>
	<li>Aspirare il PBS e trasferire le ossa isolate su un piatto sterile di coltura cellulare da 100 mm. Tenendo ogni osso usando forcep fini, tagliare accuratamente le epifisi ad ogni estremità usando piccole forbici che sono state sterilizzate in autoclave. Posizionare le ossa tagliate nei set di tubi preparati.</li>
	<li>Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 35 s a 4 °C.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, confermare che il midollo osseo è stato rimosso con successo dalle ossa. Le ossa dovrebbero apparire bianche e traslucide con un pellet rosso relativamente grande nella parte inferiore del tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Scartare il tubo di microcentrifugo da 0,5 ml. NOTA: Se l'ispezione visiva non riesce a rilevare il midollo osseo nella parte inferiore del tubo da 1,5 ml, tagliare nuovamente l'osso e ripetere il passaggio 4.3.</li>
	<li>Rimossare il midollo osseo in 1 ml di PBS ghiacciato, quindi trasferire la sospensione cellulare dallo stesso genotipo a un tubo conico da 50 ml abbinato.</li>
	<li>Dissociare le cellule passandole attraverso un ago da 18 G con una siringa da 10 ml 10 volte.</li>
	<li>Filtrare le sospensioni a cella singola attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Aggiungere ulteriore PBS ghiacciato a un volume finale di 10 mL e rimorsi le cellule attraverso l'uso delicato dell'ausilio per pipette.</li>
	<li>Centrifuga a 310 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 10 mL di supporti RPMI senza siero. Risparmiare 30 μL di questo materiale per il conteggio delle celle.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare con un contatore cellulare e calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per il trapianto. Per l'esempio di un BMT al 100%, sono necessarie 5 x 106 cellule del midollo osseo per ogni mouse ricevente. NOTA: Per un BMT competitivo, preparare un totale di 5 x 106 cellule del midollo osseo comprendenti una miscela di cellule donatrici (ad esempio, CD45.2+) e cellule concorrenti (ad esempio, CD45.1+). Si consiglia vivamente di preparare cellule extra del midollo osseo. Ad esempio, se ci sono 10 topi ricevente per gruppo sperimentale, in genere prepariamo abbastanza cellule per 12 topi ricevente.</li>
	<li>Trasferire il volume calcolato della sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 50 ml. Centrifuga a 310 x g per 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule utilizzando la quantità calcolata di mezzo RPMI privo di siero per ottenere la densità e il volume delle cellule appropriati. Tipicamente, 200 μL è il volume ottimale per un'iniezione retro-orbitale.</li>
</ol>5. Trapianto di cellule del midollo osseo a topi irradiati
<ol><li>Anestetizzare i topi riceventi con il 5% di isoflurane.</li>
	<li>Mentre i topi vengono anestetizzati, iniettare lentamente 200 μL di cellule del midollo osseo nella vena retro-orbitale usando un ago da 28-30 G con una siringa per insulina.<ol>
<li>In alternativa, eseguire il parto delle cellule donatrici per iniezione endovenosa della vena di coda e iniezione endogeno femorale, con un volume massimo rispettivamente di 0,2 mL e 25 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta iniettate le cellule, posizionare una goccia di collirio contenente proparacaina sulla superficie dell'occhio per alleviare il dolore. L'animale può quindi essere autorizzato a riprendere conoscenza.</li>
</ol>6. Trapianto di cellule del midollo osseo a topi non condizionati
<ol><li>Anestetizzare i topi riceventi per inalazione del 5% di isoflurane.</li>
	<li>Iniettare 5 x 106 cellule nonfractionate del midollo osseo da entrambi i genotipi retrò orbitalmente in topi ricevente non irradiati con siringa per insulina da 28-30 G.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.1 e 6.2 in 3 giorni consecutivi, in modo che i topi ricevente verranno trapiantati con un totale di 1,5 x 107 cellule del midollo osseo. NOTA: Poiché il BMT adottivo senza procedura di precondizione richiede il trapianto di midollo osseo per 3 giorni consecutivi, si dovrebbe tentare di alternare gli occhi per ogni iniezione.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, somministrare una goccia di collirio contenente proparacaina all'occhio interessato.</li>
</ol>

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<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li>
<li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li>
<li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per gli studi sull'ematopoiesi clonale, abbiamo descritto tre metodi di BMT: BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione con schermatura parziale e un metodo BMT meno comunemente usato che non comporta precondi condizionamento (BMT adottivo). Questi metodi sono stati utilizzati per valutare l'impatto dell'ematopoiesi clonale sulle malattie cardiovascolari. I ricercatori possono modificare questi metodi di conseguenza per soddisfare lo scopo specifico del loro studio.
Mo...

L'ematopoiesi clonale (CH) è una condizione che si osserva frequentemente negli individui anziani e si verifica come risultato di un fusto ematopoietico espanso e di un clone della cellula progenitrice (HSPC) che porta una mutazione genetica1. È stato suggerito che all'età di 50 anni, la maggior parte degli individui avrà acquisito una media di cinque mutazioni esoniche in ogni HSPC2, ma la maggior parte di queste mutazioni comporterà poche o nessuna conseguenza fenotipica per l'individuo. Tuttavia, se per caso una di queste mutazioni conferisce un vantaggio competitivo all'HSPC, ad esempio promuovendone la proliferazione, l'autorinovità, la sopravvivenza o qualche combinazione di queste, ciò potrebbe portare all'espansione preferenziale del clone mutante rispetto agli altri HSPC. Di conseguenza, la mutazione si diffonderà sempre più attraverso il sistema ematopoietico poiché l'HSPC mutato dà origine a cellule del sangue mature, portando a una distinta popolazione di cellule mutate all'interno del sangue periferico. Mentre mutazioni in dozzine di diversi geni driver candidati sono stati associati a eventi clonali all'interno del sistema ematopoietico, tra questi, le mutazioni nel DNA metiltransferasi 3 alfa (DNMT3A) e dieci undici traslocazioni 2 (TET2) sono le più prevalenti3. Diversi studi epidemiologici hanno scoperto che gli individui che portano queste mutazioni genetiche hanno un rischio significativamente più elevato di malattie cardiovascolari (CVD), ictus e mortalità per cause3,4,5,6,7. Mentre questi studi hanno identificato che esiste un'associazione tra CH e aumento dell'incidenza di CVD e ictus, non sappiamo se questa relazione sia causale o un epifenomeno condiviso con il processo di invecchiamento. Per ottenere una migliore comprensione di questa associazione, sono necessari modelli animali adeguati che ricapitolano correttamente la condizione umana di CH.
Diversi modelli di animali CH sono stati stabiliti dal nostro gruppo e altri utilizzando zebrafish, topi e primati non umani8,9,10,11,12,13,14. Questi modelli utilizzano spesso metodi di ricostituzione ematopoietica mediante trapianto di cellule geneticamente modificate, a volte utilizzando la ricombinazione Cre-lox o il sistema CRISPR. Questo approccio consente l'analisi di una specifica mutazione genica nelle cellule ematopoietiche per valutare come contribuisce allo sviluppo della malattia. Inoltre, questi modelli spesso impiegano cellule congeniche o reporter per distinguere gli effetti delle cellule mutanti dalle cellule normali o di tipo selvaggio. In molti casi, è necessario un regime di precondizione per innestare con successo le cellule staminali ematopoietiche del donatore.
Attualmente, il trapianto di midollo osseo ai topi riceventi può essere diviso in due categorie principali: 1) condizionamento mieloablativo e 2) trapianto non condizionato. Il condizionamento mieloablativo può essere ottenuto con uno dei due metodi seguenti, vale a dire l'irradiazione totale del corpo (TBI) o la chemioterapia15. Il TBI viene effettuato sottopose il ricevente a una dose letale di irradiazione gamma o a raggi X, generando rotture di DNA o collegamenti incrociati all'interno di cellule che si dividono rapidamente, rendendoleirreparabili 16. Busulfan e ciclofosfamide sono due farmaci chemioterapici comunemente usati che interrompono la nicchia ematopoietica e allo stesso modo causano danni al DNA alle cellule che si dividono rapidamente. Il risultato netto della precondizione mieloablativa è l'apoptosi delle cellule ematopoietiche, che distrugge il sistema ematopoietico del ricevente. Questa strategia non solo consente il successo dell'innesto degli HSPC donatori, ma può anche prevenire il rifiuto dell'innesto sopprimendo il sistema immunitario del ricevente. Tuttavia, la precondizione mieloablativa ha gravi effetti collaterali come danni a tessuti e organi e alle loro cellule immunitarie residenti, nonché distruzione della nicchia nativa del midollo osseo17. Pertanto, sono stati proposti metodi alternativi per superare questi effetti collaterali indesiderati, in particolare per quanto riguarda i danni agli organi di interesse. Questi metodi comprendono l'irradiazione protetta dei topi riceventi e il BMT adottivo per i topinon condizionati 9,17. La protezione del torace, della cavità addominale, della testa o di altre regioni dall'irradiazione mediante il posizionamento di una barriera di piombo protegge i tessuti di interesse dagli effetti dannosi dell'irradiazione e mantiene la loro popolazione di cellule immunitarie residenti. D'altra parte, il BMT adottivo degli HSPC per i topi non condizionati ha un ulteriore vantaggio perché preserva la nicchia ematopoietica nativa. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli e i risultati dell'innesto HSPC dopo diversi regimi di trapianto nei topi, in particolare la consegna di HSPC ai topi TBI, ai topi parzialmente schermati dall'irradiazione e ai topi non condizionati. L'obiettivo generale è quello di aiutare i ricercatori a comprendere i diversi effetti fisiologici di ogni metodo e come influenzano i risultati sperimentali nella definizione di CH e malattie cardiovascolari.

<table><tbody><tr><td>Microcentrifuga da 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>alimentazione generale</td></tr><tr><td>1/2 cc SIRINGA DA INSULINA LO-DOSE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (200 prfof)</td><td>Fisher chemical</td><td>200559</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>BD 1mL Tubercolina Siringhe 25G 5/8 pollici Ago</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>alimentazione generale</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Ago 18G (1,22 mm X 25 mm)</td><td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Cesio-137 Irradiatore</td><td>J. L. Shepherd</td><td>Attrezzatura Mark IV</td><td></td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>alimentazione generale</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Piastra per colture cellulari trattate con TC Scienze</td> della <td>vita</td><td>353003</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Provette per centrifuga coniche Fisher</td><td>Scientific</td><td>352098</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Filtri per cellule sterili Fisherbrand, 70 &; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td> fornitura <td>generale</td></tr><tr><td>Forbici fini temprate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14090-09</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>Soluzione di isotesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Zoetis</td><td>043-304</td><td>iniezione</td></tr><tr><td>Kimwipes Delicate Task Tergicristalli</td><td>Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Solution</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Disco irradiatore per roditori</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>fornitura generale</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Medium Sulfamethoxazole e Trimethoprim</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>iniezione</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>iniezione</td></tr><tr><td>Irradiatore a raggi X</td><td>Rad source</td><td>Attrezzatura RS-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

L'ematopoiesi clonale è una condizione prevalente associata all'età che deriva dall'accumulo di mutazioni somatiche nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Le mutazioni nei geni dei driver, che conferiscono forma fisica cellulare, possono portare allo sviluppo di cloni HSPC in espansione che danno sempre più origine a leucociti progenie che ospitano la mutazione somatica. Poiché l'ematopoiesi clonale è stata associata a malattie cardiache, ictus e mortalità, lo sviluppo di sistemi sperimentali che modellano questi processi è fondamentale per comprendere i meccanismi che sottinero a questo nuovo fattore di rischio. Le procedure di trapianto di midollo osseo che coinvolgono il condizionamento mieloablativo nei topi, come l'irradiazione totale del corpo (TBI), sono comunemente utilizzate per studiare il ruolo delle cellule immunitarie nelle malattie cardiovascolari. Tuttavia, il danno simultaneo alla nicchia del midollo osseo e ad altri siti di interesse, come il cuore e il cervello, è inevitabile con queste procedure. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali causati da TBI: 1) trapianto di midollo osseo con schermatura di irradiazione e 2) BMT adottivo a topi non condizionati. Negli organi schermati, l'ambiente locale è preservato consentendo l'analisi dell'ematopoiesi clonale mentre la funzione delle cellule immunitarie residenti non è perturbata. Al contrario, il BMT adottivo per topi non condizionati ha l'ulteriore vantaggio che sia gli ambienti locali degli organi che la nicchia ematopoietica sono conservati. Qui, confrontiamo tre diversi approcci di ricostituzione delle cellule ematopoietiche e discutiamo i loro punti di forza e limiti per gli studi sull'ematopoiesi clonale nelle malattie cardiovascolari.

Per confrontare l'effetto di tre metodi BMT/precondizionamento sull'innesto cellulare del donatore, le frazioni di cellule donatrici nel sangue periferico e nel tessuto cardiaco sono state analizzate dalla citometria a flusso a 1 mese dopo la BMT. Le cellule isolate sono state macchiate per specifici marcatori di leucociti per identificare i diversi sottoinsiemi di leucociti. In questi esperimenti, le cellule del midollo osseo donatrici di tipo selvatico(WT) C57BL/6 (CD45.2) sono state consegnate al WT ...

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Il nostro protocollo aiuterà i ricercatori a comprendere gli effetti fisiologici di tre diversi metodi di trapianto di midollo osseo e come influenzano i risultati sperimentali nell'impostazione dell'ematopoiesi clonale. Il trapianto totale di midollo osseo con radiazioni corporee può avere un impatto negativo sugli organi cardiovascolari e alterare la patogenesi della malattia. Pertanto, il nostro laboratorio ha sviluppato due metodi alternativi per ridurre al minimo o evitare possibili effetti collaterali.A dimostrare le procedure saranno Eunbee Park, una studentessa laureata, e Megan Evans un post-dottorato, entrambi del mio laboratorio Per la schermatura del torace e dell'addome, posizionare il vassoio regolabile e l'irradiatore a raggi X alla giusta distanza per ottenere un'irradiazione uniforme. E posizionare i topi anestetizzati su una piastra a led piatta invertita l'uno all'altro in posizione supina. Fissare le zampe alla piastra con del nastro adesivo e posizionare la schermatura a led in modo che l'estremità inferiore si allinei con l'osso xiphisternum e l'estremità superiore dello scudo di piombo si si sieda vicino al timo.Dopo la schermatura, posizionare i topi nell'ir

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

Descriviamo un protocollo in base al quale il condizionamento con busulfan permette di sostituire il midollo osseo di un topo ricevente con cellule di midollo osseo provenienti da topi donatori che esprimono ubiquitariamente la proteina fluorescente verde, in assenza di irradiazione. Questa tecnica è utile per studiare l'accumulo di cellule del midollo osseo nel sistema nervoso centrale.

Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Questo protocollo fornisce linee guida passo dopo passo per l'impostazione di esperimenti competitivi di trapianto di midollo osseo di topo per studiare la funzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche senza previa purificazione delle cellule staminali mediante selezione cellulare.

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Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

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Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

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Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Scopri tre metodi di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale. Queste procedure alternative riducono gli effetti collaterali dell'irradiazione totale sul sistema cardiovascolare.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

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