Name: Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per limaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Impara l'imaging cerebrale intero in Drosophila melanogaster durante il comportamento. Questo metodo consente di osservare l'attività neuronale in tempo reale mentre la mosca cammina e risponde a stimoli sensoriali.

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Ringraziamo Heidi Miller-Mommerskamp per l'aiuto tecnico e Iveth Melissa Guatibonza Arevalo per i commenti utili sul manoscritto. Le prime versioni del protocollo furono sviluppate nel laboratorio di Ralph Greenspan. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG), in particolare attraverso una sovvenzione FOR2705 (TP3) all'IGK, e dalla fondazione Simons (Aimon – 414701) e dal Kavli Institute for Brain and Mind (numero di sovvenzione #2017-954) ricevuto da SA.

Tutti i passaggi vengono eseguiti sotto uno stereomicroscopio.
1. Preparazione del titolare
<ol><li>Stampare il supporto 'FlyholderVJove.stl' (vedere Materiale supplementare) con una stampante 3D o stamparlo utilizzando servizi online (Figura 1A). Sia SLS (Nylon PA12) che multijet fusion (PA12) sono adatti.</li>
	<li>Creare lo slot della testa.<ol>
<li>Posizionare un pezzo di nastro adesivo rettangolarmente su una superficie piana. Tagliare una fetta di circa 5 mm x 1 cm. Tagliare la fessura del collo (~400 x 400 μm) al centro del lato più lungo del nastro utilizzando lame parallele fisse (due lame bisturi bloccate insieme) per garantire la stessa larghezza in ogni supporto(Figura 1B).</li>
		<li>Posizionare il nastro sul lato più piatto del foro nel supporto sul lato inferiore (vedere figura 1C e figura 1D). Il nastro può essere deformato spingendolo verso il basso con forcep ~ 500 μm intorno al foro; ciò ridurrà ulteriormente al minimo l'ostacolo ai movimenti di volo successivi.</li>
		<li>Coprire il nastro e il supporto dall'alto con smalto nero per evitare che il tampone perda. Lo smalto nero proteggerà anche gli occhi della mosca dalla luce di eccitazione del microscopio. Lasciare asciugare lo smalto almeno un'ora prima di utilizzare il supporto.</li>
		<li>Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, aggiungere ~1 μL di grasso nella fessura della testa utilizzando un tessuto arrotolato per assicurarsi che la colla non bagni la parte posteriore della testa della mosca(Figura 2A). Assicurarsi di non mettere grasso al di fuori dello slot che impedirebbe alla colla di attaccarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creare lo slot del corpo (Figura 2B).<ol>
<li>Facoltativamente, preparare il nastro che verrà utilizzato per posizionare in anticipo il corpo della mosca (vedi sotto). Utilizzate il progetto mostrato nella figura 2B (in alto) per tagliare un pezzo di nastro largo ~2 cm in due e tagliare fette larghe 1,5 mm. Ritaglia le spalle profonde 0,3 mm e la fessura del corpo. Assicurarsi che si adatti al supporto. NOTA: La variabilità tra le dimensioni della mosca (in particolare con sesso, età, genotipo o specie) può rendere necessario regolare il design del nastro. Se la testa tende ad essere mal centrata, può essere utile aggiungere temporaneamente un pezzo di nastro a forma di V sulla fessura del collo (Figura 3). Applicare anche alcuni microlitri di grasso all'interno della fessura del collo e sul nastro a forma di V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Posizionare la mosca
NOTA: Le mosche femminili vecchie da uno a quattro giorni sono ideali perché la testa femminile è più grande e quindi più facile da sezionare rispetto alla testa maschile, e le mosche più giovani hanno cuticola più morbida. Per gli esperimenti a piedi l'attività della mosca può essere aumentata abbinando gli esperimenti a tempi di maggiore attività circadiana (ZT0 o ZT11), utilizzando salina contenente glucosio (come 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM di trealosio 2 H2O, 10 mM di glucosio, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), morendo di fame la mosca fino a 24 ore con un ambiente solo acqua e riscaldando l'ambiente a ~28 °C durante l'esperimento. Tagliare le ali con almeno un giorno di anticipo aiuta anche a ridurre i tentativi di volare e quindi aumentare la frequenza degli attacchia piedi 7,29,30.
<ol><li>Riempire un coperchio della scatola di punta della piastra di Petri o della pipetta con ghiaccio, posizionare un tessuto di laboratorio sopra il ghiaccio e mettere il supporto a testa in giù su di esso.</li>
	<li>Trasferire una mosca sul ghiaccio per paralizzarla succhiarla dal flaconcino in un tubo e soffiarla sul ghiaccio (assicurarsi che il ghiaccio non si sciolga, il che affogherebbe la mosca).</li>
	<li>Quando la mosca smette di muoversi, utilizzare forcep opache per farla scivolare nel supporto con il collo all'interno della fessura (la mosca può essere tenuta alla base dell'ala) come nella figura 4 (asinistra). Gli occhi devono essere in posizioni uguali rispetto ai lati della fessura(Figura 4,al centro). Se necessario, aggiungere 1 μL di grasso sulla parte superiore della testa per evitare che la colla (vedere il passo successivo) raggiunga la parte posteriore della testa e rimuoverla in seguito.</li>
	<li>Coprire il corpo con un fazzoletto e un po 'di ghiaccio per assicurarsi che la mosca non si muova durante questo passaggio e il successivo(Figura 4,a destra). Un'altra opzione per evitare che le gambe raggiungano la testa è quella di utilizzare un pezzo di nastro appena sotto la testa (vedere figura 6).</li>
</ol>3. Fissare la testa
<ol><li>Posizionare la testa con un angolo di ~20° da una vista completamente posteriore (attorno all'asse laterale, vedere figura 5A). Questo è un compromesso tra la riduzione della profondità all'immagine e dall'altro lato mantenendo la gamba anteriore libera di muoversi e riducendo al minimo l'allungamento del collo.</li>
	<li>Con un tessuto arrotolato (Figura 5B), mettere la colla UV intorno alla testa evitando di sporcare l'area sensoriale di interesse (antenne, proboscide e /o occhi). Per gli esperimenti di gusto, estrarre la proboscide e aggiungere colla alla sua base per prevenire il movimento. Se non è previsto alcun esperimento di gusto, la proboscide è meglio spinta in testa e fissata con colla per ridurre al minimo il movimento(Figura 6).</li>
	<li>Curare la colla con luce UV per 5 s. Pulire con cura l'ambiente circostante della testa con un tessuto arrotolato per rimuovere la colla liquida rimanente che potrebbe attaccarsi alle gambe e / o alle aree sensoriali del suolo. NOTA: Il nastro può essere sgrossato con carta vetrata per aumentare l'adesione della colla, se necessario.</li>
	<li>Utilizzare una sottile striscia di nastro adesivo o un tessuto arrotolato per spostare le gambe nella parte anteriore (se non lo sono già), in modo che non siano danneggiate dal passaggio successivo.</li>
</ol>4. Posizionamento del corpo
NOTA: questo passaggio deve essere eseguito rapidamente; prima che la mosca si riprenda dall'anestesia.
<ol><li>Rimuovere il contenitore di ghiaccio e ruotare il supporto. Rimuovere l'acqua intorno alla mosca con un fazzoletto.</li>
	<li>Posizionare il nastro dello slot del corpo (creato nel passaggio 1) sopra il foro e spingere delicatamente verso il basso il corpo della mosca(Figura 7). Fare attenzione a non allungare troppo il collo.</li>
</ol>5. Sigillare il foro
<ol><li>Coprire eventuali fori di grandi dimensioni rimanenti con nastro adesivo.</li>
	<li>Aggiungere ~1 μL di grasso alla parte posteriore della testa e nella zona del collo per assicurarsi che nessuna colla si bagni lì.</li>
	<li>Con un tessuto arrotolato, dipingere la colla UV intorno e sopra il nastro e sul torace (parte dorsale superiore del mesonoto) per fissarlo. Curare la colla con luce UV per ~ 5 s. NOTA: È importante ridurre al minimo l'uso della luce UV in quanto può influire fortemente sulla salute della mosca.</li>
	<li>Pulire con cura il grasso e la colla non cartolar con un tessuto da laboratorio.</li>
	<li>Metti ~1 mL di soluzione salina sopra la testa. Spingere le bolle d'aria da parte con le forcep. Cerca le perdite posizionando un coverslip sopra la salina e girando il supporto per verificare la presenza di soluzione salina sul lato anteriore. In caso di perdite, rimuovere la salina e fissare il foro (aggiungendo più colla o più grasso). NOTA: Questo può essere un buon momento per mettere in pausa, se necessario. Alla mosca può essere offerto un piccolo pezzo di tessuto o palla di polistirolo su cui camminare per evitare di scorticare e calmare la mosca verso il basso.</li>
</ol>6. Sezionare la testa
NOTA: utilizzare le forcep affilate per i passaggi seguenti. Le forcep molto fini sono critiche in quanto le forcep opache renderanno più difficile aprire la cuticola della testa e possono portare a lesioni aggiuntive sulla testa o sul cervello della mosca. Un forte ingrandimento può aiutare in questa fase. A tal fine, si può sostituire l'oculare del microscopio binoculare con 30x oculari.
<ol><li>Effettuare due tagli alla base del triangolo cuticolare scuro centrale su ciascun lato del collo (vedere croci nella figura 8A).</li>
	<li>Tagliare intorno al triangolo scuro e rimuovere questa parte della cuticola.</li>
	<li>Il buco nel cervello attraverso il quale vanno il muscolo 16 e l'esofago dovrebbe ora essere visibile e muoversi ritmicamente(Video 1 presenta questo movimento ritmico in una mosca con muscoli fluorescenti). Pizzicare con cura la parte superiore di quest'area per tagliare il muscolo 16 senza forare l'esofago. Se il movimento ritmico del cervello si è fermato, il muscolo 16 è stato probabilmente rimosso, tuttavia, il movimento a volte si ferma e si riavvia in seguito. È quindi importante prestare attenzione ai movimenti ritmici ed eseguire nuovamente questo passaggio, se necessario.</li>
	<li>Tagliare la cuticola rimanente a piccoli pezzi e rimuoverla con attenzione. Cerca di non tirare troppo sulla cuticola. Invece usa le forcep come un paio di forbici, per tagliare pezzi di tessuto. Si può iniziare sui bordi mediali, dove il triangolo scuro è stato rimosso prima e lavorare la strada verso i lati. NOTA: I pezzi di cuticola possono essere utilizzati per raschiare delicatamente i corpi grassi se presenti.</li>
	<li>Rimuovere i sacchi d'aria un pezzo dopo l'altro afferrandoli con le pinza e tirando lentamente e costantemente.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La drosofilia è uno dei rari animali adulti in cui l'intero cervello può essere immaginato durante comportamenti complessi. Qui, presentiamo un metodo per preparare la mosca ed esporre tutto il suo cervello all'immagine dell'intera attività cerebrale in corso. Va notato diversi punti importanti.
Sezionare un piccolo animale come D. melanogaster è impegnativo. Il metodo richiede quindi molta pratica e pazienza per padroneggiarlo. Tuttavia, dopo l'allenamento, la procedura richiede meno di 30 minuti e produce risultati riproducibili.
Il metodo che abbiamo presentato ha ulteriori limitazioni. In primo luogo, inclinare la testa della mosca dalla sua posizione naturale porta ad allungare il collo che potrebbe essere dannoso per il tessuto connettivo, i nervi o il muscolo. In secondo luogo, sebbene la zona subesofagea ventrale (SEZ) sia otticamente accessibile, è al di sotto dell'esofago semitrasparente, che diminuisce l'intensità e la risoluzione in quest'area. Infine, anche se il supporto è fuori portata nella maggior parte delle direzioni, la mosca a volte si rende ancora conto della sua presenza e spinge su di essa per cercare di fuggire.
Nonostante questi limiti, i dati completi ottenuti dall'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli renderanno possibile decifrare la funzione cerebrale a livello dell'intera rete quando l'animale interagisce e naviga in ambienti complessi e naturalistici.

L'imaging dell'attività cerebrale utilizzando varie tecniche ha approfondito la comprensione della funzione cerebrale. Nell'uomo, le tecniche di imaging cerebrale hanno limitazioni importanti: mentre la risonanza magnetica funzionale (fMRI) offre una risoluzione spazio-temporale molto al di sotto della risoluzione del singolo neurone, tecniche veloci come l'elettroencefalografia (EEG) consentono solo l'accesso indiretto e parziale alcervello 1. In modelli animali sufficientemente grandi come i roditori, la registrazione di sensori di attività fluorescente (ad esempio GCaMP) utilizzando microscopi montati sulla testa consente di osservare l'attività cerebrale mentre l'animale si muove nel suoambiente 2. Tuttavia, queste tecniche attualmente danno accesso solo a una piccola porzione del cervello. Gli animali fissi alla testa possono essere immagini più complete, ma la copertura è ancora parziale (ad esempio, la superficie della corteccia3). È solo nei piccoli animali, come le larve di zebrafish, C. elegans e Drosophila che l'intero cervello può essere immaginato con risoluzione temporale e spaziale a livello o vicino a singoli neuroni4.
D. melanogaster è particolarmente promettente perché è stato a lungo utilizzato come organismo modello genetico5 e sono stati sviluppati potenti strumenti genetici6. Completata dalla nuova rete anatomica su larga scala derivata dalla microscopia elettronica7, la mosca potrebbe fornire opportunità uniche per studiare dinamiche cerebrali complesse generate su una rete su largascala 8. Sebbene la cuticola non sia trasparente e debba quindi essere rimossa per immaginare il cervello, l'imaging funzionale in vivo è diventato sempre più comune dal primo studio nel 20029 e diversi protocolli sono già stati pubblicati. Tuttavia, questi metodi prevedono la separazione della testa di moscadal corpo 10,la limitazione grave dei movimenti della mosca e/o le risposte agli stimoli11,12,13,14,15,o consentire solo una piccola parte cervello da imaged9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Per completare questi approcci tuttavia potenti, abbiamo recentemente sviluppato una preparazione per l'immagine di tutto il cervello durante il comportamento e le risposte a varistimoli 28.
Qui, costruiamo su questo studio per presentare un metodo specificamente sviluppato per l'immagine di tutto il cervello mentre la mosca esegue un comportamento semi-naturalistico (cioè camminare e toelettatura) e risponde a stimoli sensoriali. Ciò si ottiene utilizzando un supporto di osservazione progettato per dare accesso a tutto il cervello dal lato dorsale-posteriore, lasciando intatte le antenne e la proboscide e permettendo alla mosca di muovere le gambe per camminare (ad esempio, su una palla ammortizzata ad aria). I passi per sezionare la parte posteriore della testa sono stati perfezionati per velocità, riproducibilità e per ridurre al minimo il loro effetto sulla vitalità e sulla mobilità della mosca.

<table><tbody><tr><td>#5 pinze</td><td>FST by DUMONT</td><td>11252-30</td><td>punta dritta 0,05 x 0,02 mm, Dumoxel, lunghezza 11 cm</td></tr><tr><td>#55 pinze</td><td>FST by DUMONT</td><td>11255-20</td><td>punta dritta 0,05 x 0,02 mm, Inox, lunghezza 11 cm</td></tr><tr><td>30x oculari</td><td>yegren</td><td>WF30-9-30-H</td><td>WF30X/9 oculare ad alto campo visivo Lente ottica oculare per stereomicroscopio o microscopio biologico 30X, 30mm senza reticolo</td></tr><tr><td>AHOME/UV </td><td>torcia elettrica Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd</td><td>B07V2W9543 (ASIN)</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Fotoplast Gel/UV Colla</td><td>Dreve Otoplastik GmbH</td><td>44791</td><td>GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>Nastro trasparente con finitura lucida</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH Salviette scientifiche/di precisione</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td>11 x 21 cm</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD/Microscopio luce</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>WF30X/9</td></tr><tr><td>Nail Lacqueur</td><td>Opi Products Inc., N. Hollywood</td><td>6306585338</td><td>soluzione salina nera</td></tr><tr><td>: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl saccarosio trealosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Werner Dorsch GmbH</td><td>78 621; B07SXCXWFS (ASIN)</td><td>manico morbido</td></tr><tr><td>Grasso sottovuoto</td><td>Dow corning</td><td>0020080 /100 gr</td><td>Moly Kote 111 Grasso composto Grasso Valvola Timbro 100 g</td></tr></tbody></table>

preparazione della drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Presentiamo un metodo sviluppato specificamente per immaginiamo l'intero cervello drosofilo durante il comportamento continuo come camminare. La fissazione e la dissezione della testa sono ottimizzate per ridurre al minimo il loro impatto sul comportamento. Ciò si ottiene per la prima volta utilizzando un supporto che riduce al minimo gli ostacoli al movimento. La parte posteriore della testa della mosca è incollata a questo supporto con un angolo che consente l'accesso ottico a tutto il cervello mantenendo la capacità della mosca di camminare, governare, annusare, assaggiare e vedere. La parte posteriore della testa viene sezionata per rimuovere i tessuti nel percorso ottico e i muscoli responsabili dei manufatti del movimento della testa. Il cervello della mosca può essere successivamente immaginato per registrare l'attività cerebrale, ad esempio usando indicatori di calcio o tensione, durante comportamenti specifici come camminare o toelettatura e in risposta a diversi stimoli. Una volta che la dissezione impegnativa, che richiede una notevole pratica, è stata padroneggiata, questa tecnica consente di registrare ricchi set di dati che riguardano l'intera attività cerebrale con il comportamento e le risposte di stimolo.

La preparazione sopra descritta consente l'osservazione di tutto il cervello al microscopio per l'imaging 3D su larga scala come i classici 2 fotoni o la microscopia confocale, ma anche tecniche più veloci come la schedaluminosa 31 e altre tecniche di microscopia ad illuminazione strutturata (riviste in32),o microscopia a campoluminoso 28.
L'accesso a tutto il cervello osservando il comportamento e mantenendo gli organi sensoriali funzionali consente di rispondere a diverse domande.
In primo luogo, qual è l'attività cerebrale complessiva quando la mosca è a riposo, durante il comportamento e quando risponde agli stimoli? Ad esempio, includiamo i dati ottenuti con un microscopio a campo luminoso che mostra l'attivazione cerebrale durante le risposte agli stimoli e al comportamento. Ad esempio, in Video 2, una sonda di calcio è stata espressa in tutti i neuroni (nsyb-GAL4 e UAS-syt-GCaMP6s (a sinistra) o UAS-GCaMP6M (a destra)) ed è stato presentato uno sbuffo di odore. Si noti come la preparazione consente di ottenere una panoramica dell'attività cerebrale durante la risposta allo stimolo. I potenti strumenti genetici in Drosophila possono essere usati per limitare l'espressione di questi sensori a specifici sottotipi neuronali. In Video 3, abbiamo limitato l'espressione di un sensore di calcio ai neuroni dopaminergici e serotoninergici (TH-GAL4, DDC-GAL4 e UAS-GCaMP6M). Si noti la forte attività sincrona sul cervello strettamente correlata con la mosca che cammina, consentita osservando l'intero cervello durante il comportamento. Oltre all'attività del calcio, è possibile visualizzare altri segnali fisici o chimici (utilizzando ad esempio sensoriper tensione 28,33,prodotti delmetabolismo 34,35 o neuromodulatori specifici36).
Per comprendere il ruolo dell'attività cerebrale in modo più specifico, possiamo chiederci quali regioni sono coinvolte in quale comportamento, risposta a stimoli o modelli spontanei di attività. I dati possono infatti essere utilizzati come schermo imparziale per estrarre regioni funzionali utilizzando tecniche come l'analisi dei componenti principali e l'analisi indipendente dei componenti. La figura 9A mostra diverse regioni funzionali in colori diversi. La forma e la localizzazione delle regioni funzionali consentono di mapparle a modelli anatomici per identificare le regioni cerebrali e in alcuni casi il tipo di neurone. Inoltre, una volta allineati al modello anatomico, i valori di fluorescenza possono essere medi nelle regioni anatomiche del cervello per l'analisi quantitativa (vedi figura 9B). Ad esempio, un modello gaussiano gerarchico applicato ai dati nella figura 9B mostra che le regioni sono più attive durante la camminata (con una mediana ΔF/F di 0,029, 95% intervallo credibile=[0,017 0,041]) ma non durante lo sposo (mediana ΔF/F = -0,0049 con intervallo credibile al 95%=[-0,016 0,0059]).
Aggiungendo alla profondità di comprensione, le registrazioni simultanee delle diverse regioni funzionali consentite dalla preparazione possono essere utilizzate per studiare le proprietà dinamiche della rete funzionale. Questo è importante perché le regioni cerebrali in tutti i cervelli studiati finora sono altamente interconnesse in modo ricorrente e sempre più studi dimostrano che anche le aree sensoriali rispondono allo stato comportamentale dell'animale. Diversi aspetti possono essere esaminati come le proprietà del grafico funzionale (ad esempio, i moduli) e i modelli spazio-temporali che possono essere adatti ai sistemi dinamici (vedi8 per esempi).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione del conduttore (fase 1). A) Design del supporto (vista dall'alto). B)Preparazione delle fessure del collo. superiore: design del nastro, in basso: lame parallele utilizzate per tagliare la fessura del collo. C) Vista del conduttore dal basso. D) Vista inferiore che indica dove aggiungere il nastro dello slot per il collo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig02.jpg"> Figura 2: Ulteriori preparativi (fase 1). A) Aggiungere grasso nella fessura del collo per evitare che la colla copra la parte posteriore della testa e per evitare perdite saline. Barre di scala, 1 mm B) Superiore: forma del pezzo di nastro che verrà utilizzato per spingere il corpo verso il basso. In basso: assicurarsi che il nastro si adatti al supporto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig03.jpg"> Figura 3: Posizionamento di un nastro a forma di V per aiutare la centramento. (A)Vista in basso. (B)Vista dall'alto. Barra di scala, 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig03large.jpg" target="_blank">mm.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig04.jpg"> Figura 4: Posizionare la mosca (passaggio 2). A sinistra, utilizzare due forcep opache per posizionare il corpo in modo che il collo si trova nella fessura del collo. Al centro, allinea la testa. Gli occhi giacciono su entrambi i lati sui bordi della fessura. La testa della mosca è dritta. Bene, infila la mosca con un fazzoletto coperto di ghiaccio per impedirle di muoversi. Barra di scala, 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig04large.jpg" target="_blank">mm.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig05.jpg"> Figura 5: Fissare la testa (passaggio 3). A) Angolo ideale della testa. B)Aggiungere colla UV intorno alla testa, evitando aree sensoriali di interesse. Barra di scala, 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig05large.jpg" target="_blank">mm.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig06.jpg"> Figura 6: La punta della proboscide e le antenne possono essere tenute libere dalla colla (fase 3). Il cerchio bianco indica l'area in cui è stata applicata la colla UV. La freccia mostra quali parti sono lasciate libere dalla colla per esperimenti olfattivi e gustativi. Si noti il nastro opzionale che impedisce alle gambe di toccare l'area della colla. Barra di scala, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig07.jpg"> Figura 7: Posizionare il nastro posteriore (passaggio 4.2). Il nastro creato nel passaggio 1 (vedere figura 2, a sinistra) viene utilizzato per posizionare il corpo e coprire il grande foro nel supporto. Barra di scala, 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig07large.jpg" target="_blank">mm.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2.jpg"> Figura 8: Fasi di dissezione (passaggio 6). A-B) Tagliare su ciascun lato alla base del triangolo scuro (croci) e rimuovere questa parte della cuticola C). D)ed E) rimuovere il muscolo 16. Quindi rimuovere delicatamente il resto della cuticola F), i sacchi d'aria G) e i muscoli. H)Testa sezionata. Barra di scala, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig09.jpg"> Figura 9: Risultati rappresentativi. A) Regioni funzionali (estratte utilizzando PCA e ICA come in28) per una mosca che esprime GCaMP6 immagine pan-neuronale con un microscopio a campo luminoso (25x, NA=0,95 con un array di micro lenti f/12 corrispondente). Barra di scala, 100 μm. B) Attività media del calcio in grandi regioni cerebrali durante le risposte a stimoli e comportamenti (riprodottida 28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Muscoli 16 movimenti (fase 6.3). La GFP è stata espressa nei muscoli. Si noti il movimento di pompaggio che proviene dal foro appena sopra la trachea. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Muscle16_Movie.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Attività del calcio pan-neuronale durante la risposta all'odore per due diversi preparati. L'aceto balsamico era soffiato al volo. L'attività del calcio pan-neuronale (driver nsyb-GAL4, UAS-syt-GCaMP6s a sinistra e UAS-GCaMP6M a destra) è stata imageizzata con un microscopio a campo luminoso (25x, NA=0,95 con un array di microlenti f/12 corrispondente). Le immagini del campo luminoso sono state poi ricostruite come descritto nell'arbitro28,37. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/B9_B10CombinedStacks.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Attività del calcio in un sottoinsieme di tipo neuronale durante il comportamento. GCaMP6 è stato espresso in neuroni dopaminergici e serotoninergici (con TH-GAL4 e DDC-GAL4). In combinazione con gli strumenti genetici della mosca, la preparazione consente di osservare un forte aumento dell'attività in molte regioni durante la passeggiata. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Video3.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Materiale supplementare. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/FlyHolderVJove.stl" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Presentiamo un metodo specificamente su misura per l'immagine dell'intero cervello della Drosophila adulta durante il comportamento e in risposta agli stimoli. La testa è posizionata per consentire l'accesso ottico a tutto il cervello, mentre la mosca può muovere le gambe e le antenne, la punta della proboscide e gli occhi possono ricevere stimoli sensoriali.

Preparazione della Drosophila melanogaster adulta per l'imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Il nostro protocollo consente l'imaging dell'intero cervello della mosca durante il comportamento, che è importante per capire come i neuroni in diverse aree cerebrali interagiscono per modellare il comportamento. A differenza di altri protocolli pubblicati, questo è stato sviluppato specificamente per accedere a tutto il cervello mentre la mosca si comporta e percepisce da un odore, gusto o stimolazione visiva. Per creare uno slot per la testa.Dopo aver stampato il supporto con una stampante 3D, posizionare un pezzo di nastro adesivo rettangolarmente su una superficie piana sotto un microscopio stereo. E tagliare un pezzo di circa cinque millimetri per un centimetro. Utilizzare due bisturi fissati insieme in parallelo per tagliare uno slot successivo di 400 per 400 micrometri al centro del lato più lungo del nastro e posizionare il nastro sul lato più piatto del foro sul fondo del supporto.Utilizzare le forcep per spingere il nastro di circa 500 micrometri intorno al foro. E utilizzare lo smalto nero per coprire la parte superiore del nastro e il supporto. Dopo aver lasciato asciugare lo smalto per almeno un'ora, utilizzare un tessuto arrotolato per aggiungere circa un microlitro di grasso alla fessura della testa.Per preparare la fessura del corpo, tagliare un pezzo di nastro largo circa due centimetri in due pezzi e tagliare fette larghe 1,5 millimetri. Quindi tagliare una fessura profonda 0,3 millimetri per spalle e corpo e assicurarsi che il nastro si adatti al supporto. Per fissare una mosca nel supporto, posizionare prima un contenitore poco profondo con ghiaccio sotto il microscopio sezionato e posizionare il supporto capovolto su un pezzo di tessuto di laboratorio posto sopra il ghiaccio.Aspira una mosca di frutta femmina di uno o quattro giorni dalla sua vile e soffia la mosca su ghiaccio non fondeto. Quando la mosca smette di muoversi, utilizzare le forcep Dell per afferrare la mosca alla base delle ali e far scorrere la mosca nel supporto con il collo all'interno della fessura. Gli occhi devono essere ugualmente posizionati su entrambi i lati della fessura.Se necessario, aggiungere un microlitro di grasso sulla parte superiore della testa per evitare che la colla raggiunga la parte posteriore della testa. Quindi coprire il corpo con un fazzoletto e un po 'di ghiaccio per assicurarsi che la mosca non si muova. Per fissare la testa, posizionarla con un angolo di circa 20 gradi da una vista completamente posteriore.E utilizzare un tessuto arrotolato per applicare la colla UV intorno alla testa evitando di sporcare l'area sensoriale di interesse. Per gli esperimenti di gusto, utilizzare le forcelle per estrarre la proboscide e aggiungere colla alla base proboscide per prevenire il movimento. Se non è previsto alcun esperimento di gusto, spingere e incollare la proboscide nella testa.Curare la colla con luce UV per cinque secondi e utilizzare un tessuto arrotolato per pulire con cura le aree che circondano la testa, per rimuovere la colla liquida rimanente che potrebbe attaccarsi al terreno delle gambe e delle porte, aree sensoriali. Quindi utilizzare una sottile striscia di nastro adesivo o un tessuto per spostare le gambe nella parte anteriore se necessario. Per posizionare il corpo, rimuovere il contenitore di ghiaccio e ruotare il supporto.Rimuovere l'acqua intorno alla mosca e agire rapidamente prima che la mosca si riprenda dall'anestesia posizionare il nastro della fessura del corpo sul foro e spingere delicatamente il corpo della mosca verso il basso, facendo attenzione a non allungare eccessivamente il collo. Coprire tutti i fori di grandi dimensioni rimanenti con nastro adesivo e aggiungere circa un microlitro di grasso sul retro della testa, per evitare che la colla si attacchi in quella posizione. Utilizzare un tessuto arrotolato per dipingere la colla UV intorno al torace e sopra il nastro e il torace e curare la colla con luce UV per circa cinque secondi.Rimuovere con cura qualsiasi grasso e colla non cartolina con un tessuto da laboratorio e aggiungere circa un millilitro di soluzione salina nella parte superiore della testa. Utilizzare le flessioni per mettere da parte eventuali bolle d'aria e verificare la presenza di perdite posizionando un coperchio scivolare sopra la salina e ruotando il supporto per verificare la presenza di soluzione salina sul lato anteriore. Se si osserva una salina, rimuovere la salina e fissare il foro con più colla o più grasso.Per sezionare la testa selezionare l'ingrandimento più alto e utilizzare forcep affilate molto fini per effettuare due tagli alla base del triangolo centrale della cuticola scura su ciascun lato del collo. Tagliare intorno al triangolo scuro e rimuovere questa parte della cuticola. Il muscolo 16 e l'esofago dovrebbero essere visibili attraverso questo buco e muoversi ritmicamente.Utilizzare le forcep molto fini per pizzicare con cura la parte superiore di quest'area per remare il muscolo 16 senza forare l'esofago. Se il movimento ritmico si ferma, il muscolo 16 è stato probabilmente rimosso. Quando il muscolo è stato asportato a partire dal bordo mediale della regione del triangolo scuro, utilizzare le forcep come un paio di forbici per tagliare e rimuovere con cura la cuticola rimanente in piccoli pezzi.Quindi utilizzare le forcep per afferrare e allontanare lentamente e costantemente un sacco d'aria alla volta. In questo video è stata espressa una sonda di calcio in tutti i neuroni di questi due cervelli di mosca della frutta. E fu presentato un soffio di odore.In questo esperimento, l'espressione del sensore di calcio era limitata ai neuroni dopaminergici e sierotonergici. Si noti la stretta correlazione tra la forte attività sincrona sul cervello e il comportamento di camminata delle mosche che illustra come l'intero cervello può essere osservato durante un comportamento specifico. Utilizzando l'analisi dei componenti principali e l'analisi indipendente dei componenti è possibile estrarre diverse regioni funzionali evidenziate in diversi colori.La forma e la localizzazione delle regioni funzionali consentono di mappare le regioni a modelli anatomici. Identificare le regioni cerebrali e, in alcuni casi, i tipi di neuroni. Una volta allineati all'appropriato modello anatomico, i valori di fluorescenza possono essere mediati all'interno di specifiche regioni cerebrali anatomiche per l'analisi quantitativa.Ad esempio, in questa analisi possiamo osservare che tutte le regioni sono più attive durante le passeggiate che durante la toelettatura. Sii paziente. Imparare questa tecnica di dissezione cardiaca è difficile.Nel mio laboratorio, le persone hanno bisogno in media da tre a quattro mesi prima di padroneggiarlo e ottenere i primi preparati utili. Seguendo questo protocollo possiamo registrare l'attività cerebrale su larga scala usando un microscopio a fluorescenza. Sono particolarmente indicati metodi veloci come la microscopia a campo luminoso.

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